着丝粒蛋白CENP-LN识别CENP-A核小体的结构机与功能研究和金黄色葡萄球菌Pfk的结构与功能研究

摘要

在有丝分裂的过程中，偶联的姐妹染色单体准确平均分配到两个子细胞中，完成遗传物质的传递，对于维持遗传稳定性和物种连续性至关重要。姐妹染色单体的平均分离主要依赖于动粒在着丝粒区的组装。着丝粒是染色质上一段结构和功能都高度特化的区域，在该区域H3被其变体CENP-A所替代。动粒是在着丝粒区组装的一个大的蛋白复合体，负责为姐妹染色单体与纺锤体微管的连接建立承载区。动粒主要包括:内层CCAN蛋白质网络和外层KMN蛋白质网络。CCAN蛋白网络又可划分成五组亚复合物:CENP-C、CENP-LN、CENP-HIKM、CENP-TWSX和CENP-OPQUR。其中，CENP-N能够特异性识别CENP-A核小体，招募CENP-L，完成CENP-A所携带遗传信息的解码和起始动粒蛋白的招募。
　　在本文第一篇中，我们解析了CENP-LN/CENP-A-NCP复合物的冷冻电镜结构，整体分辨率为5.8(A)。CENP-N通过其C端约100个氨基酸与CENP-L相互作用，形成一个异二聚体，与溶液中聚集状态相吻合;通过其N端约200个氨基酸与CENP-A核小体直接相互作用，其中，CENP-A L1 loop上的R80、G81和D83对CENP-N特异性识别CENP-A核小体具有重要作用，另外，CENP-N氨基端的碱性氨基酸还可以与核小体DNA上的四个位点的磷酸骨架直接相互作用，进一步稳定两者的结合。DNA上的这四个位点分别为:第+37/+36位核苷酸、第-32/-31位核苷酸、第+26/+25位核苷酸和第-22/-21位核苷酸。我们通过体外结合实验验证了CENP-N上与DNA结合的关键氨基酸残基有K10A、R11A、R44A和H77A。在体内，与DNA相互作用的关键氨基酸位点的突变，显著减弱了CENP-N自身及CENP-L等动粒蛋白的定位，说明CENP-N与核小体DNA的结合，对CENP-N在动粒上的定位和其他动粒蛋白的招募至关重要。而且，在不同物种中，为了维持这种“解码”机制的保守性，CENP-N可与CENP-A共同进化。
　　糖酵解过程是所有生物体进行葡萄糖代谢产生ATP供能的必经阶段。在糖酵解过程中，己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶被认为是关键酶，有它们催化的反应是不可逆的。其中，磷酸果糖激酶的催化效率较低，是最为重要的调控关键酶，功能单位为四聚体，以ATP为磷酸供体，催化F6P转变为FBP，并产生一分子ADP。它是一种经典的别构酶，通过R-state和T-state的构象转变来调节自身的催化活性。
　　在本文的第二篇中，我们利用E.coli表达了金黄色葡萄球菌的Pfk，它在溶液中存在二聚体和四聚体两种状态，且蛋白浓度越高四聚体越多，而且这种四聚体状态可以被低pH，或ADP，或ATP，或AMP-PNP诱导解离为二聚体形式，但是也可以被其底物F6P所稳定。我们通过解析Pfk及其与不同配体复合物的结构发现:Sa_ Pfk、Sa_Pfk/ADP、Sa_Pfk/ATP和Sa_Pfk/AMP-PNP的结构为二聚体，Sa_Pfk/F6P和Sa_Pfk/F6P/AMP-PNP的结构为四聚体。通过结构分析，我们认为Sa_Pfk所特有的G150-L151 motif的柔性赋予了α7-helix“开关”的功能，在F6P的协同作用下，调节自身二聚体-四聚体间的转换，从而调控酶的催化活性。

目录

声明

摘要

第一篇 着丝粒蛋白CENP-LN识别CENP-A核小体的结构和功能研究

1．1 有丝分裂

1．2 着丝粒(Centromere)

1．3 动粒(Kinetochore)

1．4 着丝粒特异的组蛋白CENP-A

1．5 CENP-L／N复合物

1．6 选题意义及研究内容

第二章 实验材料和方法

2．1 目的蛋白的基因扩增和质粒构建

2．2 目的蛋白小量试表达

2．3 目的蛋白大量表达及纯化

2．4 昆虫细胞表达体系的蛋白表达及纯化

2．5 CENP-A组蛋白八聚体表达及纯化

2．6 147 bp DNA片段纯化

2．7 CENP-A核小体重组及纯化

2．8 CENP-N与CENP-A核小体复合物纯化

2．9 晶体生长及优化

2．10 电镜样品制备

2．11 冷冻电镜数据收集和三维重构

2．13 相互作用检测

2．14 RNA干扰实验

第三章 实验结果与讨论

3．1 人源CENP-L／M／N的表达和纯化

3．2 人源CENP-A核小体的重组纯化

3．3 人源CENP-N的N端可与CENP-A核小体相互作用

3．4 人源CENP-N截短体与CENP-A核小体的复合物纯化和结晶

3．5 人源CENP-L／N与CENP-A核小体的复合物纯化

3．6 人源CENP-LN／CENP-A NCP复合物冷冻电镜数据收集及处理

3．7 人源CENP-L／N与CENP-A核小体复合物结构分析

3．8 CENP-N与核小体DNA的结合对动粒组装至关重要

3．9 酿酒酵母Iml3CENP-L／Chl4CENP-N的表达纯化及晶体筛选

3．10 裂殖酵母Fta1CENP-L／Mis17CENP-M／Mis15CENP-N的表达纯化及晶体筛选

本篇小结

参考文献

第二篇 金黄色葡萄球菌中糖酵解中蛋白Pfk的结构和功能研究

第四章 综述

4．1 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

4．2 糖酵解(glycolysis)

4．3 ATP依赖的六磷酸果糖激酶(Pfk)

4．4 RNA降解体

4．5 选题意义及研究内容

第五章 实验材料和方法

5．1 目的蛋白的基因扩增和质粒构建

5．2 目的蛋白的小量试表达

5．3 目的蛋白的大量表达及纯化

5．4 凝胶过滤层析

5．5 Sa_Pfk的X射线晶体学研究

5．6 等温量热滴定(ITC)

5．7 Sa_Pfk的酶学活性分析

第六章 实验结果与讨论

6．1 Sa_Pfk在溶液中存在二体和四体两种状态

6．2 Sa_Pfk的聚集状态受多种因素调控

6．3 Sa_Pfk的整体结构

6．4 Sa_Pfk的酶学活性研究

本篇小结

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果