纳米颗粒介导CRISPR/Cas9基因编辑干预巨噬和树突状细胞功能的研究

摘要

巨噬细胞、树突状细胞是构成机体免疫系统的关键部分，是抵御病原体入侵、维持机体健康稳态的主要细胞之一。巨噬细胞是机体炎症反应和先天性免疫反应中关键的效应细胞和调节细胞;树突状细胞启动并调节高度病原特应性的适应性免疫反应，也是产生免疫记忆和免疫耐受的关键。巨噬细胞以及树突状细胞与多种疾病的发生、发展息息相关。如肿瘤相关巨噬细胞可以分泌多种细胞因子等促进肿瘤发展、转移;Ⅱ型糖尿病脂肪组织中募集的巨噬细胞分泌炎性细胞因子，导致胰岛素抵抗;树突状细胞提呈自身抗原时，激活自身反应性淋巴细胞，导致机体免疫失衡，导致自身免疫疾病发生。干预这两种细胞的功能，将有助于疾病的治疗。 本论文基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，利用阳离子脂质辅助的PEG-b-PLGA聚合物纳米颗粒(CLAN)载药体系，制备包载CRISPR/Cas9核酸药物，分别靶向巨噬细胞和树突状细胞，研究其对巨噬细胞和树突状细胞功能的干预，以及对于相关疾病治疗的效果。本论文的研究工作主要分为两部分: 1.CRISPR/Cas9基因编辑工具有望用于治疗多种疾病，我们构建了巨噬细胞特异性启动子启动的Cas9质粒系统，并且利用CLAN技术包载该质粒。在体内、体外，均实现了在巨噬细胞及其前体单核细胞中特异性Cas9蛋白表达。进一步将靶向Ntn1的gRNA(sgNtn1)构入质粒中，在体内巨噬细胞及其前体单核细胞中敲除Ntn1，减低netrin-1（Ntn1编码蛋白）表达，可显著改善Ⅱ型糖尿病的症状。与此同时，由于CD68启动子特异性启动Cas9的表达，在其它细胞中基本没有Ntn1基因的敲除。这种策略为实现纳米载体系统高效介导体内CRISPR/Cas9系统特异性基因编辑提供了新的途径。 2.重建免疫耐受是治疗自身免疫疾病的关键，而树突状细胞是诱导抗原特异性免疫耐受的重要细胞。我们利用CLANpCas9/gCD80,86,40/2.5mi成功递送靶向共刺激分子的CRISPR/Cas9系统，及自身免疫疾病Ⅰ型糖尿病相关抗原肽(2.5mi)至树突状细胞。敲低树突状细胞共刺激分子的同时提呈疾病相关抗原肽，诱导抗原特异性调节性T细胞，抑制Ⅰ型糖尿病模型鼠的发病并且恢复其正常血糖。这一策略为干预树突状细胞功能提供了新的方法，为Ⅰ型糖尿病的治疗提供了重要参考。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1.1巨噬细胞和树突状细胞的功能与疾病发生

1.1.1巨噬细胞和树突状细胞简介

1.1.2巨噬细胞和树突状细胞的功能

1.1.3巨噬细胞和树突状细胞与疾病的发生

1.2巨噬细胞和树突状细胞的功能干预与疾病治疗

1.2.1抗体

1.2.2免疫调节剂

1.2.3细胞疗法

1.3 CRISPR／Cas9基因编辑技术

1.3.1基因编辑技术介绍

1.3.2 CRISPR／Cas9的分类与应用

1.3.3 CRISPR／Cas9的递送与疾病治疗

1.4核酸纳米药物递送系统

1.4.1核酸药物递送的障碍

1.4.2核酸纳米药物递送系统的分类

1.4.3核酸纳米药物递送系统与免疫细胞功能干预

1.5选题依据及主要研究内容

参考文献

第二章CLAN纳米颗粒介导巨噬细胞特异性基因编辑的研究

2.1 引言

2.2实验材料

2.2.3主要药品及试剂

2.3实验方法

2.3.2包载CRISPR/Cas9质粒系的纳米颗粒(CLAN)的制备

2.3.3 CLAN对siRNA及CRISPR/Cas9质粒的包封率、回收率的测定

2.3.4 CLAN纳米颗粒粒径及表面电势的表征

2.3.5 CLAN纳米颗粒的形态表征

2.3.7检测不同细胞转染CLANpM458后Cas9和EGFP的表达

2.3.9检测CLANpM458在小鼠体内单核巨噬细胞中EGFP和Cas9的表达

2.3.10检测CLANpM330/sgNtn1对巨噬细胞Ntn1基因的敲除效率

2.3.11建立高脂饮食诱导Ⅱ型糖尿病(T2D)小鼠模型

2.3.13检测CLANpM330/sgNtn1治疗结束后Ntn1基因的敲除效率

2.4.2巨噬细胞特异性CD68启动子启动的CRISPR/Cas9质粒的鉴定

2.4.3 CLAN纳米颗粒的制备及表征

2.4.4CLAN纳米颗粒包载CRISPR/Cas9质粒在细胞水平的转染效果

2.4.5体外验证CD68启动子启动的Cas9-EGFP在巨噬细胞中特异性表达

2.4.6体内验证CD68启动子启动的Cas9-EGFP在巨噬细胞中特异性表达

2.4.7 CLANpM330/sgNtn1敲除Ntn1基因的效率检测

2.4.8 CLANpM330/sgtn1对T2D疾病小鼠模型的治疗效果

2.4.9 CLANpM330/sgNtn1治疗后细胞因子分泌、脂肪组织巨噬细胞滞留情况表征

2.4.10 CLANpM330/sgNtn1治疗后脱靶效应评估

2．5本章小结

参考文献

第三章CLAN纳米颗粒递送CRISPR/Cas9及杭原肽干预树突状细胞功能的研究

3.1引言

3.2实验材料

3.2.3主要药品及试剂

3.3实验方法

3.3.2体外转录靶向CD80、CD86以及CD40的gRNA

3.3.3包载CRIPSR/Cas9质粒以及抗原肽的CLAN纳米颗粒的制备及表征

3.3.4检测CLAN纳米颗粒递送质粒和抗原肽至BMDC的能力

3.3.5检测CLANpCas9/gCD80,86,40/2.5mi对BMDC共刺激分子的敲除效率

3.3.7小鼠CD4+T细胞分离培养

3.3.8检测CLANpCas9/gCD80,86,40/2.5mi转染后BMDC与T细胞的作用

3.3.10检测CLANpCas9/gCD80,86,40对体内树突状细胞的编辑效率

3.3.14检测CLANpCas9/gCD80,86,40/2.5mi治疗结束后细胞因子分泌

3.4实验结果

3.4.2 CLAN纳米颗粒的制各和表征

3.4.3 BMDC对包载CRISPR/Cas9和抗原肽的CLAN纳米颗粒的摄取

3.4.4 CLANpCas9/gCD80,86,40/2.5mi转染BMDC后的基因编辑效率以及抗原的提呈

3.4.5 CLANpCas9/gCD80,86,40/2.5mi转染BMDC后对T细胞的抗原提呈

3.4.6 CLANpCas9/gCD80,86,40对体内树突状细胞的基因编辑

3.4.7 CLANpCas9/gCD80,86,40/2.5mi对T1D疾病小鼠模型的治疗

3.4.8 CLANpCas9/gCD80,86,40/2.5mi治疗后T1D小鼠抗原特异性Treg细胞的产生

3.4.9CLANpCas9/gCD80,86,40/2.5mi治疗后T1D小鼠炎症细胞因子的分泌

3．5本章总结

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文与研究成果