基于新型二维纳米材料Ti3C2构建RNA荧光检测传感平台

摘要

二维纳米材料由于具有独特的纳米片结构、大的比表面积等独特的物理化学性质而引起了科学家们的极大兴趣，其中新型二维纳米材料过渡金属碳/氮化物(MXenes)已广泛应用于储能、催化、吸附、生物传感、复合材料等领域。与传统的二维材料相比，Ti3C2MXenes拥有较大的比表面积以及优异的电导率，在400-1200nm光谱范围内具有广谱吸收，能作为良好的荧光猝灭剂。基于二维纳米材料设计的荧光传感方法，具有灵敏度高、选择性好等特点已被广泛应用于生命分析、疾病诊断等领域。本文围绕聚丙烯酸(PAA)修饰的Ti3C2MXenes构建了一系列DNA荧光纳米探针，将对目标物的识别过程转换为光学信号，实现了多种RNA的检测分析，主要开展了以下研究内容：　　1、核酸功能化Ti3C2荧光纳米探针(Ti3C2-AS-let7a-nanoprobe，缩写TLNP)的构建及其应用于let7a的检测分析。通过氟化锂(LiF)和盐酸(HCl)一步刻蚀法制备Ti3C2MXenes，并对其表面进行聚丙烯酸(PAA)修饰，最后通过EDC/NHS偶联反应在Ti3C2MXenes共价修饰荧光基团标记的DNA探针(AS-let 7a)。修饰在Ti3C2MXenes表面的AS-let7a保持着发夹构型，其5'端修饰的荧光团与Ti3C2MXenes的表面接近，发生荧光共振能量转移(FRET)，导致AS-let7a的荧光被猝灭。当let7a与AS-let7a发生杂交反应形成双链，发夹结构被打开，导致荧光基团远离Ti3C2MXenes表面，破坏了FRET过程，从而恢复TLNP的荧光。实验结果证明了TLNP具有良好的选择性和灵敏度，响应let7a的线性范围是0-60nM，检测限为1.0nM。这项工作揭示了以Ti3C2MXenes为平台构建的荧光纳米探针在生物传感等领域中具有巨大的应用潜力。　　2、响应丙型肝炎病毒(HCV)RNA基因组的Ti3C2荧光纳米探针(MB-1-Ti3C2)的构建并用于HCV(+)RNA的检测及成像。在研究内容1的基础上，我们设计了特异性识别和结合HCV(+)RNA的分子信标AS-HCV(+)，通过EDC/NHS反应将其偶联至PAA-Ti3C2MXenes表面，成功构建了MB-1-Ti3C2荧光纳米探针。MB-1-Ti3C2可以特异性识别HCV(+)RNA并通过杂交反应打开发夹结构AS-HCV(+)，抑制荧光共振能量转移，导致荧光恢复。该探针在体外检测中具有良好的选择性和特异性，其线性范围为0-60nM，检测限为1.2nM。此外，实验证明MB-1-Ti3C2具有较高的细胞渗透效率以及低毒性，通过与宿主细胞进行孵育，成功实现了活细胞中HCV(+)RNA的检测及成像，这有助于疾病的诊断和病毒侵染机理的研究。　　3、双响应Ti3C2荧光纳米探针(MB-Ti3C2)的构建及其用于HCV正链和负链的体外同时检测。在研究内容2的基础上，我们将特异性识别HCV(+)RNA和HCV(-)RNA的荧光基团标记的分子信标DNA通过EDC/NHS偶联至PAA-Ti3C2MXenes表面，成功构建了荧光纳米探针MB-Ti3C2。该探针在体外能对两种目标物的进行高灵敏度和高选择性同时检测，其中检测HCV(+)RNA的检测限为1.6nM，HCV(-)RNA的检测限为1.4nM。这项工作可为体外同时检测HCV正负链RNA提供一个新的工具。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 光学生物传感方法

1.1.1 光学生物传感方法简介

1.1.2 光学生物传感方法的分类

1.2 二维纳米材料

1.2.1 纳米材料概述

1.2.2 二维纳米材料

1.2.3 二维过渡金属碳/氮化物（MXenes）

1.3 基于二维纳米材料的光学生物传感

1.3.1 核酸检测

1.3.2 蛋白质检测

1.3.3 小分子检测

1.4 本论文研究思路

第2章 Ti3C2 MXenes的制备及其在miRNA荧光检测中的应用研究

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 实验试剂与仪器

2.2.2 Ti3C2 MXenes的合成

2.2.3 PAA修饰Ti3C2 MXenes的合成

2.2.4 材料的表征实验

2.2.5 凝胶电泳分析实验

2.2.6 TLNP荧光纳米探针的合成

2.2.7 荧光猝灭效率实验

2.2.8 选择特异性实验

2.2.9 灵敏度分析实验

2.3 结果与讨论

2.3.1 Ti3C2 MXenes的表征

2.3.2 PAA-Ti3C2 MXenes的表征

2.3.3 PAA-Ti3C2 MXenes的猝灭效率

2.3.4 可行性验证

2.3.5 TLNP的选择特异性分析

2.3.6 TLNP的灵敏度分析

2.4 小结

第3章 基于Ti3C2 MXenes构建荧光探针对HCV病毒基因组正链RNA序列的检测及成像

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 实验试剂与仪器

3.2.2 凝胶电泳分析实验

3.2.3 MB-1-Ti3C2的合成

3.2.4 选择特异性实验

3.2.5 灵敏度分析实验

3.2.6 实时荧光动力学实验

3.2.7 干扰实验

3.2.8 细胞培养

3.2.9 细胞毒性实验

3.2.10 活细胞中HCV(+)RNA的荧光成像实验

3.2.11 实时荧光定量PCR反应（RT-PCR）

3.3 结果与讨论

3.3.1 基于Ti3C2 MXenes检测HCV(+)RNA传感平台的构建

3.3.2 可行性验证

3.3.3 MB-1-Ti3C2的特异性分析

3.3.4 MB-1-Ti3C2的灵敏度分析

3.3.5 HCV(+)RNA的活细胞成像

3.4 小结

第4章 基于Ti3C2 MXenes构建RNA荧光双检测传感平台

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 实验试剂与仪器

4.2.2 凝胶电泳分析

4.2.3 MB-Ti3C2的合成

4.2.4 选择特异性分析实验

4.2.5 灵敏度分析实验

4.2.6 实时荧光动力学实验

4.3 结果与讨论

4.3.1基于Ti3C2 MXenes双检测传感平台的构建

4.3.2 可行性验证

4.3.3 MB-Ti3C2的选择特异性分析

4.3.4 MB-Ti3C2的灵敏度分析

4.4 小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢