抗GM-CSF自身抗体协助感染诊断预后与人源D-二聚体核酸适体筛选

摘要

根据受感染部位的不同，真菌感染性疾病可分为浅部真菌感染、皮下真菌感染和系统性真菌感染。侵袭性真菌感染包括皮下真菌感染和系统性真菌感染。侵袭性真菌感染危害显著，是医院感染的重要类型。真菌感染发病慢，死亡率高，虽有抗真菌药物可用于临床治疗，但其死亡率依旧居高不下。与真菌有关的死亡病例中大部分由以下四种真菌引起，即：隐球菌、念珠菌、曲霉和肺孢子虫。　　新型隐球菌引起的感染，是条件致病感染，但在免疫正常与免疫低下的人群中都有发生,脑膜炎是隐球菌病最常见的表现。隐球菌通过巨噬细胞转运，或通过粘附或破坏脑血管上皮细胞穿过血脑屏障，感染大脑。患者出现头痛、发烧、萎靡不振和精神状态改变，颅神经麻痹和其他局灶性神经功能缺损，以及意识水平低下以及认知功能障碍。全球范围内，隐球菌性脑膜炎在低免疫人群中具有高致病性与高死亡率。为快速鉴定隐球菌性脑膜炎并在后续治疗中用药提供指导，通常使用脑脊液检查作为诊断CNS感染的关键步骤。　　本研究中,我们的样本共纳入在2014年12月至2018年6月之间的11名来自上海公共卫生临床中心的隐球菌脑膜炎患者。研究发现CM患者的脑脊液中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)自身抗体水平升高，其在疾病恢复期间自身抗体水平总体呈现下降趋势，且GM-CSF稍微升高。在患者7的脑脊液与GM-CSF共同刺激THP-1细胞后，细胞中的TNF-α表达水平低于GM-CSF单一刺激下所产生的。实验表明，GM-CSF自身抗体的存在影响患者免疫力，并可作为急诊鉴定与临床监测疾病活动度的辅助标准。常规实验室受制于实验设备与实验技术，难以准确检测到中和性抗GM-CSF自身抗体。因此，我们分析了常规生物标志物与自身抗体的相关性。检测中，脑脊液乳酸脱氢酶(LDH)(P=0.0085)，蛋白质(P=0.0472)和腺苷脱氢酶(ADA)(P=0.0123)呈现上升趋势，脑脊液氯化物(P=0.0462)与葡萄糖(P＝0.0173)都略有降低。该趋势可作为辅助标准预测自身抗体含量变化或作为是否进一步检测自身抗体表达量的评价标准。　　综上所述，从CM恢复期间观察到抗GM-CSF自身抗体水平降低，这可能在监测CM疾病活动时有用。目前还需更多的数据表明抗还需要更多的数据来证明抗GM-CSF抗体在临床监测疾病活动度，观测疾病的严重性，预测并监测治疗后患者的反应，以及对患者预后进行预测等方面的作用。　　当隐球菌感染时，机体出现炎症反应，各种炎症标志物含量出现变化。在本实验中，我们选择了临床广泛使用的炎症与凝血标志物D-二聚体作为研究对象，希望能筛选出核酸适体替代现有D-二聚体试剂盒。当机体发生感染和炎症时，纤维蛋白溶解活性的增加和D-二聚体等副产物的增加，使得损伤限制在小区域，从而防止机体的进一步损害。D-二聚体因此进入机体，泄漏到循环中，因此可以在感染及炎症发生时症检测到D-二聚体水平上升。此外，血清D-二聚体还是脓毒症以及其细菌感染的主要预后标志物。D-二聚体检测方法多种多样，主要的检测方法通常是基于胶乳凝集原理和ELISA原理。其中胶乳凝集和免疫层析法通常用于定性或半定量检测，在定量实验中，通常采用ELISA的方法。这些方法各有优劣，胶乳凝集法灵敏度过低，容易出现假阴性，从而耽误治疗；而传统ELISA法适用大批量样本检测，这两种方法均不适合用于急诊。随着技术的发展优化，多种速度快、灵敏度高的单人样本检测方法已经被发明出来，但在实际检测中，却容易受类风湿，肝素，及脂血等物质的干扰，且不同的ELISA试剂盒测量值存在差异。临床检测D-dimer阈值依各个厂家的标准设定，市面上无通用标准。　　为满足市场需求，本文拟筛选D-dimer核酸适体，代替传统抗体在临床上运用，克服传统抗体不易保存，成本高昂，检测不够快速灵敏，需要特定仪器检测等缺点。通过SELEX筛选核酸适体。核酸适体在临床诊断方面的应用前景十分广阔，可看作是新型的化学抗体。相较于抗体，核酸适体具有很多优点，其高特异，高稳定性，使核酸适体作为临床诊断材料具有重要意义。

目录

声明

本文所用英文缩写表

1. 绪论

1.1 真菌感染与诊断

1.1.1 隐球菌感染

1.2 结核杆菌感染

1.3 巨噬细胞与免疫反应

1.4 细胞因子与免疫反应

1.4.1 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子与自身抗体

1.4.2 肿瘤坏死因子-α

1.4.3 γ干扰素

1.4.4 白介素17A

1.5 D-二聚体与核酸适体

1.5.1 D-二聚体

1.5.2 核酸适体

1.6 本课题研究目的、内容和意义

1.6.1 研究目标

1.6.2 研究内容

1.6.3 研究意义

2. CM患者恢复期脑脊液抗GM-CSF自身抗体降低

2.1 前言

2.2 实验仪器与试剂材料

2.2.1 实验仪器

2.2.2 实验试剂与材料

2.2.3 相关试剂配制

2.3 实验方法

2.3.1 研究对象

2.3.2 研究方法

2.4 结果

2.4.1 人口统计学与临床特征

2.4.2 疾病发作期间脑脊液中和性抗GM-CSF自身抗体的检测

2.4.3 高表达的自身抗体对免疫的影响

2.4.4 其他生化指标与自身抗体的相关性分析

2.5 结论与讨论

3. D-二聚体核酸适体筛选

3.1 前言

3.2 实验仪器与试剂材料

3.2.1 实验仪器

3.2.2 实验试剂与材料

3.2.3相关试剂配制

3.3 实验方法

3.3.1 D-二聚体耦联于磁珠

3.3.2 蛋白质耦联检测

3.3.3 核酸适体筛选

3.3.4 筛选压力选择

3.3.5 筛选文库富集检测

3.4 结果

3.4.1 蛋白质耦联检测

3.4.2 核酸适体筛选

3.5 结论与讨论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢