新型纳米体系用于生物组织成像及肿瘤治疗的应用研究

摘要

实时监控疾病标志物在细胞内的浓度和分布情况对于疾病的早期诊断、预防和及时治疗具有重要意义。在众多的成像技术中，光学成像和磁共振成像被广泛的应用。其中，基于荧光探针的荧光成像技术具有高灵敏度、时空分辨成像和对细胞几乎无损伤等特点，是一种强有力的细胞内疾病标志物监测工具。然而，现有的单光子荧光探针存在穿透深度浅、光漂白、细胞内自荧光干扰等缺点。双光子荧光成像技术是利用能量更低的双光子作为激发光源的一种技术，由于激发波长更长，它能够实现更深的组织穿透深度，降低对细胞和组织的损伤，并能够抗背景荧光干扰。因此，双光子荧光探针更适合用于复杂生物体系的研究。　　近年来，纳米技术在科学和工程领域取得了快速的发展。纳米材料独特的尺寸效应使其在催化、能源、生物成像和药物传递等领域得到了广泛的应用。基于纳米颗粒的纳米传感器和纳米药物，以及诊疗体系的应用得到快速发展。常用于构建探针和诊疗体系的纳米材料包括纳米金颗粒、金属有机骨架(MOFs)、配位聚合物等，它们具有较大的负载能力、优良的生物相容性以及细胞膜穿透能力。因此以纳米材料为基础构建的纳米探针和诊疗平台在复杂生物体系研究中具有广阔的应用前景。　　为了提高现有荧光探针的稳定性和成像效果，解决纳米诊疗平台药物载量低、合成复杂等问题，本论文利用成像技术和纳米材料的优势，开发了一系列适于复杂生物体系的纳米探针和抗肿瘤诊疗纳米体系。具体内容如下：　　1)在第二章中，由于传统的功能核酸——纳米金单光子荧光探针难以应用于复杂生物体系中的成像，我们将双光子荧光分子结合到脱氧核酶(8-17DNAzyme)——纳米金体系中。该探针具有高的双光子吸收截面和光稳定性，并且对目标检测物锌离子有很好的选择性。此外，该探针的细胞毒性低，具有很好的生物相容性。相比于单光子荧光探针，该探针用于成像细胞中锌离子时，体现了更好的成像效果。而且，我们将该探针应用于小鼠组织切片中锌离子的成像，结果显示其成像深度可达160μm,远高于单光子荧光探针的成像深度。该探针设计方案具有普适性，适用于构建其他的基于功能核酸的双光子荧光纳米探针。　　2)在第三章中，基于金属有机骨架(MOFs)的尺寸可调节性、好的生物相容性和生物降解性，将由锆和带有叠氮基团的有机配体组装而成的金属有机骨架(PCN-58)作为基础构建单元，通过合成后修饰的方法，构建双光子金属有机骨架探针(TP-MOF)用于活细胞和组织中锌离子的成像。该纳米探针背景信号低，进入细胞后，在锌离子存在的条件下，双光子识别基团与锌离子结合产生增强的荧光信号。相比于单光子荧光探针，TP-MOF有更高的成像分辨率。这种探针构建方法为推动MOFs在生物医学领域中的应用提供了一个通用性策略。　　3)由于机体内硫化氢失调与多种疾病相关，比如：高血压、心肌缺血等疾病。因此，了解硫化氢在生物体内的分布对于疾病的早期诊断有着重要的意义。然而，双光子有机小分子探针抗细胞内蛋白质等分子干扰的能力较差，容易产生假阳性信号，因此在细胞层面的应用受限。MOFs骨架纳米孔道的筛分作用，有望提高小分子探针的抗干扰能力，降低假阳性，实现荧光探针在活细胞和组织层面的应用。因此，在第四章中，将MOFs与双光子荧光探针相结合构建的纳米探针，在进入细胞后，探针的响应位点被细胞中的硫化氢分子激活，实现细胞和组织中硫化氢的成像。该探针比基于介孔硅的纳米探针有着更好的检测性能。此外，在细胞裂解液的条件下，该探针相比于有机小分子探针有更好的抗干扰能力，这主要得益于MOFs孔道对于分子尺寸的筛分作用。该探针为检测复杂体系中的硫化氢提供了更好的策略。　　4)MOFs因具有尺寸可调节性、好的生物相容性和生物降解性而被广泛应用于生物医学成像和药物递送。然而，基于MOFs的药物载体存在负载率低、构建复杂等缺点，应用受限。一个理想的药物载体往往具备药物载量高、生物相容性好、可控释药等优点。在第五章中，运用临床上常用的抗癌药物五氟尿嘧啶(FU)作为桥连配体与锰离子通过“一锅法”配位组装成一个新型的金属药物配位纳米材料——Mn-FU。Mn-FU的药物负载量高达47.7%，高于大部分基于纳米材料的药物递送体系。通过合适的表面修饰，该体系体现了很好的肿瘤富集效果，并实现了肿瘤微环境激活药物释放，提高了五氟尿嘧啶的生物利用率，增强了抗肿瘤治疗的特异性。此外，在药物释放的同时，锰离子从Mn-FU中释放，作为磁共振成像造影剂，用于监控药物释放，有利于判断药物递送效果和预测治疗效果。活体抗肿瘤治疗实验说明Mn-FU提高了放化疗协同治疗效果，并降低了毒副作用。该体系的设计方法为构建理想的诊疗体系提供了一种高效而便捷的策略。

目录

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第 1 章 绪 论

1.1成像技术在生物分析中的应用

1.1.1 荧光成像技术

1.1.2 磁共振成像技术

1.2 纳米材料

1.2.1 纳米金颗粒

1.2.2 配位聚合物纳米材料

1.2.3 金属有机骨架纳米材料

1.3 新型纳米体系在生物医学领域的应用

1.3.1 在成像检测中的应用

1.3.2 在抗肿瘤治疗中的应用

1.4 本论文的构想

第 2 章 基于金纳米颗粒的双光子荧光探针用于组织中锌离子成像研究

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂与仪器

2.2.2 双光子荧光分子的合成

2.2.3 纳米金的合成

2.2.4 荧光纳米探针的制备

2.2.5 荧光测定

2.2.6 纳米探针的细胞毒性实验

2.2.7 细胞内锌离子的双光子荧光成像

2.2.8 组织切片中锌离子的双光子荧光成像

2.3 结果与讨论

2.3.1 纳米探针的设计原理

2.3.2 纳米探针的表征

2.3.3 纳米探针的检测性能

2.3.4 纳米探针的选择性

2.3.5 纳米探针的细胞毒性

2.3.6 活细胞中锌离子的双光子荧光成像

2.3.7 组织切片中锌离子的双光子荧光成像

2.4 小结

第 3 章 基于金属有机骨架的双光子荧光纳米探针对组织中锌离子的成像

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂与仪器

3.2.2 双光子荧光分子的合成

3.2.3 基于金属有机骨架的双光子荧光纳米探针的合成

3.2.4 探针的体外检测实验

3.2.5 探针在生物环境中的稳定性实验

3.2.6 探针的细胞毒性实验

3.2.7 细胞内锌离子的成像实验

3.2.8 组织中锌离子的成像实验

3.3 结果和讨论

3.3.1 探针的设计原理

3.3.2 探针的结构表征

3.3.3 探针的双光子性质表征

3.3.4 探针的体外检测性能

3.3.5 探针的生物稳定性

3.3.6 探针的细胞毒性

3.3.7 探针成像细胞内锌离子

3.3.8 探针成像组织中的锌离子

3.4 小结

第 4 章 基于金属有机骨架的双光子荧光纳米探针对组织中硫化氢的成像

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂与仪器

4.2.2 双光子荧光分子的合成

4.2.3 TP-MOF 的合成

4.2.4 体外检测实验

4.2.5 在生物环境中的稳定性实验

4.2.6 TP-MOF 的细胞毒性实验

4.2.7 TP-MOF 用于细胞内硫化氢的成像实验

4.2.8 TP-MOF 用于组织中硫化氢的成像实验

4.3 结果和讨论

4.3.1 TP-MOF 的设计原理

4.3.2 结构表征

4.3.3 双光子性质表征

4.3.4 体外检测性能

4.3.5 生物稳定性

4.3.6 细胞毒性

4.3.7 TP-MOF 成像细胞内硫化氢

4.3.8 TP-MOF 成像组织中的硫化氢

4.4 小结

第 5 章 新型金属药物配位纳米材料用于协同放化疗和磁共振成像研究

5.1 前言

5.2 实验部分

5.2.1 试剂与仪器

5.2.2 金属药物配位纳米材料的合成

5.2.3 Mn-FU 的酸刺激药物释放实验

5.2.4 Mn-FU 的细胞毒性实验

5.2.5 DNA 损伤机制研究

5.2.6 动物模型的建立

5.2.7 Mn-FU 的表面修饰

5.2.8 磁共振成像实验

5.2.9 Mn-FU 用于活体抗肿瘤治疗实验

5.3 结果和讨论

5.3.1 设计原理

5.3.2 Mn-FU 的表征

5.3.3 Mn-FU 的酸响应药物释放和磁共振信号

5.3.4 Mn-FU 细胞毒性和生物稳定性

5.3.5 Mn-FU 用于活体 MRI

5.3.6 Mn-FU 的生物分布

5.3.7 小鼠肿瘤模型中放化疗联合治疗

5.3.8 病理学检测

5.4 小结

总 结

参考文献

附录 A 攻读学位期间发表的学术论文目录

附录 B 部分化合物的谱图

致 谢