Cas12a蛋白的附属切割活性探究及其在非核酸分析物检测中的应用

摘要

CRISPR/Cas系统是原核生物内一种基于RNA的适应性免疫系统，可以抵御外来病毒和质粒的入侵。目前基于CRISPR/Cas系统开发的基因编辑工具已经被广泛的应用于生物工程和疾病治疗等领域。2015年张锋团队发现了一种全新的Cas蛋白Cas12a，它是一种由RNA介导的靶向双链DNA的多结构域核酸内切酶。Cas12a一经发现便很快的被用于开发各种高效的基因编辑工具，在研究过程中科研人员发现Cas12a具有独特的附属切割活性：在RNA的引导下水解特定序列的双链DNA后，具有切割任意序列的单链DNA的活性。因此Cas12a既可以作为检测核酸的识别元件，同时又具有放大输出信号的功能，在核酸检测领域具有重要的应用价值，引起了广泛的关注。本文中对Cas12a的附属切割活性进行了探究，并且探索其在非核酸目标物检测的应用。本文基于Cas12a的附属切割活性和DNA连接反应，开发了一种检测生物小分子三磷酸腺苷(ATP)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的荧光生物传感方法，并将该方法拓展应用于T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)活性的检测。本文具体工作如下：　　1.LbCas12a的表达纯化及活性验证。本节构建了pET28a-LbCas12a表达载体，优化了蛋白原核表达条件，获得了纯度较高的LbCas12a的蛋白。对LbCas12a的催化活性进行了验证，探究了核酸结构对LbCas12a的附属切割活性的影响，为后续开发基于Cas12a的生物传感新方法奠定了基础。　　2.基于LbCas12a的附属切割活性和酶催化的DNA连接反应的ATP和NAD检测方法。T4DNA连接酶或E.coliDNA连接酶在它们的辅因子ATP或NAD的存在下，催化两个寡核苷酸片段DNA1与DNA2连接，连接产物可以激活LbCas12a的附属切割活性，水解荧光报告探针产生信号输出。该传感方法检测ATP和NAD的线性范围分别为0.5-100nM和1-200nM，检测限达到了50pM和10pM。　　3.基于LbCas12a的快速、灵敏检测T4PNK活性的传感新方法。将研究工作2中DNA1的5'端的磷酸基团替换成羟基后，会阻碍后续DNA连接反应。T4PNK介导的DNA磷酸化反应将5'羟基转化为5'磷酸基团，经过DNA连接反应生成的产物可以激活Cas12a水解荧光报告探针，产生荧光信号实现了对T4PNK活性的检测。该方法检测T4PNK有较宽的线性范围(0.001-0.2 U/mL)和较低的检测限(0.0005 U/mL)。并可应用于研究小分子对T4PNK活性的抑制效应，为筛选T4PNK的抑制剂提供了一种新的方法。

目录

声明

第 1 章 绪 论

1.1 CRISPR/Cas 系统简介

1.1.1 CRISPR/Cas 系统的作用机制

1.1.2 CRISPR/Cas 系统的多样性和分类

1.1.3 CRISPR/Cas 系统的应用

1.2 CRISPR/Cas12a 系统简介

1.2.1 CRISPR/Cas12a 系统的结构和作用机制

1.2.2 Cas12a 与 Cas9

1.2.3 Cas12a 在基因编辑领域的应用

1.2.4 Cas12a 在生物传感的应用

1.3 本文构思

第 2 章 Cas12a 蛋白的表达纯化和催化活性验证

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 实验试剂和设备

2.2.2 溶液配制

2.3 实验方法

2.3.1重组质粒 pET28a-LbCas12a的构建

2.3.2 LbCas12 的表达与纯化

2.3.3 LbCas12a 蛋白表达纯化实验条件的优化

2.3.4 LbCas12a 核酸水解反应

2.3.5 米氏常数的测定

2.3.6 荧光测量

2.4 结果与讨论

2.4.1重组质粒 pET28a-LbCas12a的构建

2.4.2 LbCas12 的表达与纯化

2.4.3 LbCas12a 蛋白表达纯化实验条件的优化

2.4.4 LbCas12a 催化活性的初步验证

2.4.5 核酸对 Cas12a 催化活性的影响

2.5 本章小结

第 3 章 基于 Cas12a 和 DNA 连接酶的 ATP 和 NAD 检测方法

3.1 前言

3.2 实验材料

3.2.1 实验试剂和设备

3.2.2 溶液配制

3.3 实验方法

3.3.1 ATP 和 NAD 的检测程序

3.3.2 荧光测量

3.4 结果与讨论

3.4.1 ATP 和 NAD 的检测原理

3.4.2 可行性验证

3.4.3 优化实验

3.4.4 ATP 和 NAD 的检测

3.5 本章小结

第 4 章 基于 Cas12a 和 DNA 连接酶的 T4 PNK 活性测定方法

4.1 前言

4.2 实验材料

4.2.1 实验试剂和仪器

4.2.2 溶液配制

4.3 实验方法

4.3.1 T4 PNK 的活性测定

4.3.2 抑制剂实验

4.3.3 荧光测量

4.4 结果与讨论

4.4.1 T4 PNK 活性测定原理

4.4.2 可行性验证

4.4.3 T4 PNK 活性的测定

4.4.4 T4 PNK 抑制剂实验

4.5 本章小结

结 论

参考文献

附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致 谢