AFM用于核酸适配体的裂分及其与靶标相互作用的研究

摘要

裂开型核酸适配体是指将完整的核酸适配体裂分之后得到两段核酸链，当存在靶标时，这两条核酸链又可组合起来以识别靶标。裂开型核酸适配体采用较短的核酸链，可避免形成复杂二级结构，有利于与靶标识别的构型的形成。同时还可以降低分子间相互作用产生的背景信号，因此裂开型核酸适配体已在生物传感、生物成像、药物递送和治疗等领域得到广泛的应用。鉴于目前已知的裂开型核酸适配体种类很少，迫切需要可靠的方法来获取裂开型核酸适配体。　　原子力显微镜(Atomic Force Microscope，AFM)是一种直接测定生物分子之间的相互作用力的工具，可实现在单分子水平上的生物分子信息获取，已经在化学、生物以及材料等领域得到广泛应用。鉴于AFM在生物分子间的相互作用研究存在的优势，其有望发展成获取裂开型核酸适配体的强有力工具。据此本论文首先基于AFM研究血管内皮生长因子165(VEGF165)与其裂开型核酸适配体的相互作用，证实AFM确实适合用于研究裂开型核酸适配体与靶标相互作用；然后，选用肌红蛋白为模型，利用AFM力谱技术探索肌红蛋白的裂开型核酸适配体，并将该裂分的核酸适配体应用于靶标的检测研究。具体内容如下：　　1.基于AFM研究裂开型核酸适配体与VEGF165的相互作用　　在单分子水平上研究裂开型核酸适配体与蛋白质的相互作用可提供更多生物分子信息，但是目前鲜有报道。本工作以VEGF165为模式分子，探讨了基于AFM研究裂开型核酸适配体与蛋白质相互作用的可行性。首先将裂开型核酸适配体分别修饰在AFM针尖和基底，然后利用AFM测定了VEGF165与其裂开型核酸适配体在单分子水平上的相互作用。该工作为利用AFM获取裂开型核酸适配体奠定了基础。　　2.AFM用于肌红蛋白核酸适配体裂分的研究　　由于对裂开型核酸适配体与靶标结合机理的了解不够透彻以及裂分核酸适配体的方法相对较少，目前裂开型核酸适配体仍在少数。因此，在上一个工作的基础上，本章以肌红蛋白作为模式分子，利用AFM技术探索了蛋白质的裂开型核酸适配体。首先将识别肌红蛋白的核酸适配体随机裂分获得不同的两段核酸链，然后将这两段核酸链分别修饰在AFM针尖和基底，依据裂开型核酸适配体与靶标相互作用的成键率的高低来判断裂开型核酸适配体是否与靶标结合，据此探索出三对高特异性的识别靶标的裂开型核酸适配体。该方法具有直观、可靠等优势，为裂开型核酸适配体的获取提供一个崭新的平台，有助于推动裂开型核酸适配体的开发和应用。　　3.裂开型核酸适配体用于肌红蛋白的检测研究　　利用动态光散射和表面等离子体共振传感方法结合上述获取的裂开型核酸适配体用于肌红蛋白的检测，结果发现S2-3对肌红蛋白具有最佳的亲和力。基于S2-3功能化金纳米颗粒构建的动态光散射方法和表面等离子体共振传感方法可实现人血清中的nM级的肌红蛋白的检测，可满足临床检测的需求。

目录

声明

本文所用英文缩略词表

第1章 绪论

1.1 裂开型核酸适配体概述

1.2 裂开型核酸适配体的应用

1.2.1 生物传感

1.2.2 生物成像

1.2.3 药物递送和治疗

1.3 获取裂开型核酸适配体的方法

1.3.1 荧光方法

1.3.2 流式细胞术

1.3.3 等温滴定量热法

1.4 本文拟开展的工作

第 2 章 基于 AFM 研究裂开型核酸适配体与 VEGF165的相互作用

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂和仪器

2.2.2 溶液的配制

2.2.3 AFM 针尖和金基底的修饰

2.2.4 AFM 力谱测定

2.3 结果与讨论

2.3.1 裂开型核酸适配体与 VEGF165相互作用的研究

2.3.2 浓度对裂开型核酸适配体与 VEGF165相互作用的影响

2.3.3 加载速率对裂开型核酸适配体与 VEGF165相互作用的影响

2.4 小结

第 3 章 AFM 用于肌红蛋白核酸适配体裂分的研究

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂与仪器

3.2.2 结合缓冲液的配制

3.2.3 AFM 针尖和金基底的修饰

3.2.4 AFM 力谱测定

3.3 结果

3.3.1 原理

3.3.2 核酸适配体的裂分及其与肌红蛋白相互作用的研究

3.3.3 裂开型核酸适配体的优化及其与肌红蛋白相互作用的研究

3.3.4 裂开型核酸适配体与靶标结合特性的考察

3.4 小结

第 4 章 裂开型核酸适配体用于肌红蛋白的检测研究

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂和仪器

4.2.2 溶液的配制

4.2.3 金纳米颗粒的制备与修饰

4.2.4 基于裂开型核酸适配体的 DLS 方法检测肌红蛋白

4.2.5 基于裂开型核酸适配体的 SPR 传感方法检测肌红蛋白

4.3 结果

4.3.1 金纳米颗粒的合成和修饰

4.3.2 基于 DLS 方法检测肌红蛋白

4.3.3 基于 SPR 传感方法检测肌红蛋白

4.4 小结

结论

参考文献

附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢