CSN5通过调节AsA的稳态介导水稻盐胁迫响应的分子机制

摘要

土壤盐渍化是限制水稻生长发育和影响水稻减产的重要环境因素，因此盐响应机制研究对于提高水稻耐盐性并实现高产或稳产至关重要。CSN5是COP9信号复合体与其它蛋白的相互作用时与靶蛋白结合的一个关键亚基，它也可以独立于COP9复合物存在。GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannosepyrophosphorylase,GMPase，亦称为VTC1)是植物合成抗坏血酸(AsA)的关键酶。前期有研究证明，拟南芥中CSN5和VTC1能够相互作用并促进后者被泛素化降解，而AsA-GSH循环又是植物体内清除活性氧(ROS)的重要机制。因此，为揭示CSN5调节AsA的稳态而介导水稻盐胁迫响应的分子机制，本研究围绕CSN5在水稻盐胁迫响应中的功能展开了一系列的生理生化实验。其具体研究结果如下：　　(1)通过生物信息学分析，发现OsCSN5广泛表达在水稻的茎尖分生组织(SAM)中。同时，利用荧光定量PCR的技术分析了水稻中的OsCSN5在盐、干旱和H2O2胁迫处理下的表达量变化，发现OsCSN5在盐和干旱胁迫处理下的表达水平都上调明显，尤其对盐胁迫的响应最为强烈。结果说明，OsCSN5的表达受到非生物胁迫的诱导，推测其很可能参与盐胁迫响应的调控。　　(2)利用酵母双杂交和β-半乳糖苷酶活分析验证了水稻中CSN5与VTC1-1、VTC1-3和VTC1-8均能相互作用，但CSN5与VTC1-1的互相作用要强于与VTC1-3和VTC1-8的相互作用。　　(3)为了验证CSN5在逆境响应中的功能，构建了pCAMPIA1390-CSN5过表达载体，并通过农杆菌介导的水稻转化法获得了2个OsCSN5过表达的独立株系Ubi::CSN5-1和Ubi::CSN5-17。通过对OsCSN5过表达株系与野生型(WT)进行盐胁迫处理，发现OsCSN5过表达株系呈现出对盐胁迫更为敏感，盐胁迫对其伤害较WT更严重，说明OsCSN5负调控水稻的耐盐性。　　(4)盐胁迫条件下，OsCSN5过表达株系的AsA含量显著降低，而其OsVTC1-1的转录水平却没受明显的影响，说明OsCSN5可能也是通过调控VTC1-1的稳定性而不是其转录来参与AsA稳态的调控。同时发现，OsCSN5过表达株系在盐胁迫下ROS的积累显著增加，推测可能是AsA的合成量减少，导致水稻在盐胁迫下ROS的积累而受氧化胁迫伤害更加严重。该结果初步证明，CSN5是通过调节AsA的稳态来参与水稻的盐胁迫响应。　　(5)通过对生殖生长期的OsCSN5过表达株系和野生型水稻进行盐胁迫处理，发现OsCSN5过表达株系的耐盐性显著减弱，其有效穗和分蘖数均低于野生型。该结果进一步证明，OsCSN5负调控水稻的耐盐性。　　综上所述，本研究发现过表达OsCSN5增加了水稻在盐胁迫条件下ROS的积累，降低了AsA含量和耐盐性，说明OsCSN5负调控水稻的耐盐性。同时发现，CSN5与VTC1-1相互作用，并推测CSN5可能是通过调控VTC1-1的稳定性来参与AsA稳态的调控，从而参与水稻的盐胁迫响应调控。该研究结果对水稻盐胁迫响应机制解析和耐盐品种的培育具有较高的理论和实践意义。

目录

缩略词

第 1 章 绪论

1.1盐胁迫对植物生长的影响

1.2 植物逆境胁迫中 ROS 代谢

1.3 植物抗盐机理

1.3.1 渗透调节

1.3.2 盐胁迫信号转导系统

1.3.3 ROS 的清除

1.4 水稻 CSN5 的概况

1.4.1 COP9 信号复合体的结构

1.4.2 CSN5 的功能

1.5 植物中 AsA 的研究进展

1.5.1 AsA 的合成

1.5.2 AsA 在植物体内的功能

1.6 本研究的目的与意义

第 2 章 CSN5 的基因克隆及表达模式分析

2.1 实验材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 OsCSN5 基因的生物信息学分析

2.2.2 OsCSN5 在不同胁迫下的定量表达

2.2.3 CSN5 基因的扩增克隆

2.3 本章小结

第 3 章 CSN5 与 VTC1 互作分析

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 水稻 OsVTC1 基因的克隆

3.2.2 CSN5 与 VTC1 酵母双杂交互作分析

3.2.3原核表达载体的构建及原核表达蛋白的鉴定

3.3 本章小结

第 4 章 CSN5 转基因水稻植株在盐胁迫下的表型分析

4.1 实验材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 CSN5 植物过表达载体和 CRISPR/Cas9 载体的构建

4.2.2 水稻转化

4.2.3 CSN5 过表达阳性植株的鉴定

4.2.4 水稻 CRISPR/Cas9-CSN5 突变体植株的鉴定

4.2.5 CSN5 过表达转基因水稻苗期在盐胁迫条件下的表型分析

4.2.6 对 CSN5 转基因水稻苗期在盐胁迫条件下的 AsA 的研究

4.2.7 对 CSN5 转基因水稻苗期在盐胁迫条件下的 ROS 的研究

4.2.8 VTC1-1 多克隆抗体的鉴定

4.2.9 CSN5 转基因水稻生殖生长期在盐胁迫条件下的表型分析

4.3 本章小结与讨论

结论

参考文献

附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢