内皮细胞中切应力响应基因筛选及SRGN的功能研究

摘要

心脑血管疾病严重危害人类健康，其中中老年群体的发病率最高，容易导致脑卒中致残甚至死亡，是世界各地医务工作者亟待解决的疾病。据统计，2016年有1790多万人死于心脑血管疾病，占全球疾病死亡人数的首位，即使采用目前最先进的治疗手段，也只能起到缓解作用，无法完全克服。　　众所周知，在心脑血管疾病的发病过程中，位于血管内壁的血管内皮细胞（Endothelial Cells，ECs）所发挥的功能起着至关重要的作用。ECs与血液直接接触并受到血流剪切应力（Fluid Shear Stress，FSS）的作用。而FSS发生异常则是导致动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）发病的关键刺激因素，更是AS局灶性的主要原因，局部切应力的大小和流场的改变通过影响ECs的发育、增殖、凋亡等生物学过程进而导致ECs功能异常，促使AS在内的多种心血管疾病发生。虽然已有不少力学敏感基因的筛选和研究，但目前的研究还不足以阐明异常力学环境引发ECs功能改变的机制。　　以往的研究通过对体外培养的ECs施加不同力学处理用于筛选差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）作为力学敏感因子，而本研究注意到体外发育的斑马鱼胚胎在受精后24-26小时（24-26hour-post-fertilization,hpf）产生血流，基于此，本文提出科学假设“在斑马鱼发育从无血流到有血流的过程中，ECs中力学敏感基因的表达会发生显著变化”。因此本研究利用生物信息学手段对斑马鱼胚胎24hpf前后的转录组以及基因芯片数据进行分析和挖掘，期待找到相应的关键节点基因。通过进一步分析这些关键基因及其上下游通路，更好的了解心血管疾病的发病机理，为临床治疗心血管疾病提供理论基础。本文主要研究内容和结论如下：　　第一部分：FSS作用前后斑马鱼ECs中DEGs的筛选　　利用斑马鱼发育过程中血流出现在24hpf这一特性，从GEO数据库中筛选斑马鱼胚胎24hpf前后的ECs高通量数据进行数据挖掘分析，最终找到两组数据集（GSE126617和GSE20707）纳入研究。接着通过加载R语言中的“edgeR”程序包以及GEO2R在线分析工具对斑马鱼发育不同时期中的DEGs进行筛选，发现两组数据集中有6个共同的DEGs（SRGN,SLC12A3,SLC25A4,PVALB1,ITGAE.2,zgc:198419）响应血流剪切应力。进一步通过比较这些基因在斑马鱼和人类之间同源性同时确保两组数据结果的一致性，最终确定了4个差异基因（SRGN,SLC12A3,SLC25A4,PVALB1）进行下一步验证研究。　　第二部分：SRGN作为力学敏感基因的体外研究　　①通过平行平板流动腔力学加载系统体外对人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）使用5dyne/cm2的力进行加载，力学处理6h后，提取HUVECs总RNA，使用荧光定量PCR的方法验证4个差异基因的表达情况。结果发现在低剪切应力（Low Shear Stress，LSS）作用下，差异基因的表达都发生了显著性变化，其中丝甘蛋白聚糖（Serglycin，SRGN）主要表达于造血细胞、内皮细胞以及胚胎干细胞中，被认为与心血管的健康密切相关，因此选择SRGN展开进一步研究。　　②使用Promo在线分析软件对SRGN上游启动子区域的转录因子结合位点进行预测，结果发现在上游123bp处存在一个CREB结合位点。以往的研究也证明了cAMP/PKA/CREB信号通路可以将力学信号传递到ECs中进而调控基因表达。因此本研究使用PKA抑制剂（H89）处理HUVECs，同时对细胞施加LSS，通过荧光定量PCR，免疫荧光以及ELISA检测SRGN的表达情况后发现，H89能够显著地抑制SRGN对FSS的响应。　　第三部分：SRGN与AS的相关性研究　　①通过免疫荧光技术和Griess法分别检测力学加载后Ki-67阳性细胞中SRGN高表达的细胞比例以及ECs中NO的含量，发现SRGN在促进ECs增殖的过程中发挥作用，而使用H89处理细胞后，SRGN的作用被显著抑制。　　②研究采用了颈动脉局部结扎法对ApoE-/-小鼠进行手术，用于构建切应力致AS模型。手术结束后使用高脂饲料喂养4周，然后分别取小鼠左右颈动脉组织用于制作冰冻切片。使用免疫荧光技术观察发现SRGN主要表达在出现明显斑块的左颈总动脉（LCA）的ECs中，而在右颈总动脉（RCA）中几乎不表达。同时，我们还发现SRGN集中表达在AS斑块疑似血管新生的区域中，这暗示SRGN可能通过促进ECs增殖影响AS斑块中的血管新生，促使易损斑块的形成进而诱发继发性血栓危害人类健康。

目录

主要缩略词表

1 绪 论

1.1 问题的提出

1.2.1AS 发病机制

1.2.2 血管内皮细胞对AS发生与发展过程的影响

1.2.3 血流剪切应力调控ECs 功能

1.2.4 生物信息学技术用于研究剪切应力响应基因

1.2.5 用于研究AS的动物模型

1.2.6 Serglycin（SRGN）的研究近况

1.3.1 本文的研究目的

1.3.2 本文的研究内容

1.3.3 本文的研究意义

1.4.1 理论基础

1.4.2 研究基础

2 生物信息学筛选力学敏感基因

2.1 引言

2.2.1 基因表达数据库（GEO 数据库）

2.2.2 基因本体论数据库（GO数据库）

2.2.3 KEGG信号通路数据库

2.2.4 生物信息学分析工具

2.3 研究方法

2.3.1 差异表达基因的筛选

2.3.2 差异表达基因功能富集分析

2.3.3 共同差异表达基因筛选

2.4 研究结果

2.4.1 原始数据筛选和预处理

2.4.2 差异表达基因的筛选

2.4.3 差异表达基因功能富集分析

2.4.4 共同DEGs筛选

2.5 小结与讨论

3 差异表达基因的体外验证

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 实验仪器和耗材

3.2.2 实验试剂

3.3 实验方法

3.3.1 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养

3.3.2 体外细胞切应力加载

3.3.3 荧光定量PCR

3.3.4 细胞免疫荧光

3.3.5 ELISA 检测

3.3.6 转录因子结合位点预测

3.3.7 实验分组与统计分析

3.4 实验结果

3.4.1 力学刺激影响差异基因在ECs 中的表达

3.4.2 LSS促进SRGN 在HUVECs中的表达

3.4.3 SRGN 的上游转录因子预测

3.4.4 SRGN 通过cAMP/PKA/CREB信号通路响应血流剪切应力

3.5 小结与讨论

4 SRGN 在ECs 中的功能及其与AS的相关性研究

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 实验仪器和耗材

4.2.2 实验试剂

4.2.3 实验动物

4.3 实验方法

4.3.1 细胞培养及力学加载处理

4.3.2 细胞免疫荧光双染色

4.3.3 NO 浓度检测

4.3.4ApoE-/-小鼠颈动脉结扎模型构建

4.3.5 小鼠颈动脉冰冻切片及免疫荧光染色

4.3.6 实验分组与统计分析

4.4 实验结果

4.4.1 SRGN 促进HUVECs 增殖

4.4.2 SRGN 与AS斑块形成密切相关

4.5 小结与讨论

5 结论与展望

5.1 主要结论

5.2 后续工作展望

参考文献

附 录

A. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录

B. 作者在攻读硕士学位期间参与的科研项目

C. 学位论文数据集

致谢