Ptk2b基因在肺炎克雷伯氏菌诱导的小鼠乳腺炎症反应中的作用研究

摘要

奶牛乳腺炎，作为奶牛乳腺组织中由多种侵袭性病原体引起的一种生产性炎症疾病，其发病率很高，是世界范围内奶牛养殖业中最常见、最重要的疾病之一。为了筛选与中国荷斯坦奶牛乳腺炎显著相关SNP位点和标记易感性或抗性基因，进一步了解中国荷斯坦奶牛乳腺炎性状的遗传和生物学途径。我们首先利用2b-RADseq技术对中国奶牛全基因组进行测序，标记与中国荷斯坦奶牛乳腺炎差异显著相关的基因。并进行相关验证：在牛外周血白细胞(bPBLs)、牛乳腺上皮细胞(bMECs)和奶牛乳腺组织分析相关筛选基因与炎症发生、发展相关的基因mRNA表达水平来评估候选基因与炎症的关联性。同时用肺炎克雷伯氏菌刺激乳腺上皮细胞，检测相关炎症因子和下游关键因子的表达差异，以确定标记基因的相关分子机制。结果表明：在患有临床乳腺炎奶牛bPBLs，肺炎克雷伯氏菌刺激的bMECs中，Ptk2b(蛋白酪氨酸激酶2β)表达水平均下调，在患有乳腺炎的奶牛乳腺组织，肺炎克雷伯氏菌刺激的bMECs中，Nf-Κb(核因子-κB)、Nlrp3(炎症小体3)和Akt1(酪氨酸蛋白激酶1)的mRNA表达水平则有较大幅度的上调。在肺炎克雷伯氏菌刺激的bMECs中，炎症因子Il-1β、Il-8的mRNA表达水平逐渐增高，Il-10的表达水平先增高后降低。说明Ptk2b是与乳腺炎相关的重要候选基因。并且调控促炎症因子Il-8(白介素8)、Il-1β(白介素1β)和免疫抑制因子Il-10(白介素10)的表达水平，参与调控机体的炎症反应。　　为了构建肺炎克雷伯氏菌感染小鼠模型,初步探究小鼠乳腺炎发病过程中的分子机制。试验采用传统细菌培养的方法从奶样中分离出致病菌,提取基因组DNA进行PCR快速检测和测序比对。选取12只泌乳期雌鼠(Balb/C),每只小鼠一侧乳区注射100μL生理盐水作为对照组,在对侧乳区注射100μL浓度为1×109cfu/mL肺炎克雷伯菌液作为感染组。在处理后第1天(24 h)、2天(48 h)、4天(96 h)、8天(192 h)依次取样,每次3只。采用H.E.染色法观察小鼠乳腺生理病理学变化；实时荧光定量PCR法检测候选基因PTK2B和炎症相关基因Nlrp3、Tlr2(Toll样受体2)、Nf-Κb、Il-10、Il-1β、Akt1和Tlr4(Toll样受体4)mRNA水平的表达。采用Westernblot方法检测小鼠乳腺组织PTK2B、NLRP3和TLR4蛋白的表达水平。结果表明:成功从奶样中分离并鉴定得到肺炎克雷伯氏菌。对照组第1,2天的乳腺腺泡组织结构完整,轮廓清晰,第4,8天的乳腺上皮细胞发生溶解并伴有少量脂肪细胞浸润；感染组的主要病理症状为乳腺上皮细胞之间排列松散,伴有大量脂肪细胞浸润,并随着感染时间的增加小鼠乳腺组织的病理学变化逐渐增大。感染组的Nlrp3和Tlr2的mRNA表达显著升高(P＜0.01),Nf-Κb、Akt1、和Il-10表达水平上调，Il-10的表达水平先增高后逐渐降低，Tlr4的mRNA表达与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。说明成功构建奶牛肺炎克雷伯氏菌小鼠乳腺炎模型。Ptk2b、Tlr2、Nlrp3参与肺炎克雷伯氏菌小鼠乳腺炎的发生,且白介素Tlr4的mRNA表达水平无显著变化。

目录

声明

第一章 文献综述

1 奶牛乳腺炎概述

2 奶牛乳腺炎的病原学研究现状

2.1 乳腺炎与病原微生物

2.2 乳腺炎的免疫应答

2.3 乳腺炎与遗传因素

2.4 乳腺炎的预防与诊断

3 肺炎克雷伯氏菌与奶牛乳腺炎

4 Ptk2b基因与炎症因子相关概述

4.1 Ptk2b基因相关研究

4.2 PAMP识别受体：Toll样受体家族

4.3 炎症因子相关概述

5 本研究的意义

6 本研究的思路

参考文献

第二章 PTK2B基因的筛选及体外验证

1实验材料

1.1实验动物

1.2试剂及仪器

1.3 主要溶剂的配置

2 实验方法

2.1独立样本验证显著性的SNPs

2.2 血液总RNA提取和mRNA转录水平分析

2.3实时荧光定量分析法分析奶牛乳腺组织mRNA转录水平

2.4肺炎克雷伯氏菌感染bMECs与mRNA转录水平分析

3 结果与分析

3.1 独立样本群体验证Ptk2b

3.2 PBLs中PTK2B与炎症因子表达变化

3.3奶牛乳腺组织中PTK2B与炎症因子表达变化

3.4 肺炎克雷伯氏菌刺激bMECs中Ptk2b与炎症因子表达变化

4 讨论

参考文献

第三章 肺炎克雷伯氏菌感染小鼠乳腺炎模型的建立

1 材料与建模

1.1 实验材料及分组

1.2 奶样

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

2 实验方法

2.1 致病菌的分离

2.2 致病菌的分子生物学鉴定

2.3 小鼠乳房炎模型的建立和乳腺组织学观察

2.4 小鼠乳腺组织H.E.染色

2.5 实时荧光定量PCR扩增

2.6 Western blot法检测小鼠乳腺组织PTK2B、NLRP3 和TLR4的蛋白表达水平

2.7 统计学分析

3 实验结果

3.1 致病菌菌落形态

3.2 肺炎克雷伯氏菌的分子生物学鉴定

3.3 肺炎克雷伯氏菌感染小鼠乳腺组织的病理变化

3.4 小鼠乳腺组织H.E染色结果

3.5 小鼠乳腺组织感染前后Ptk2b和相关炎症因子mRNA转录水平变化

3.6 小鼠乳腺组织感染前后Il-10及Il-1β的表达变化

3.7 小鼠乳腺组织中PTK2B、TLR4和NLRP3蛋白表达变化

4 讨论

参考文献

第四章 实验结论与展望

1实验结论

2实验展望

致谢

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