针刺手厥阴经穴对缺血再灌注损伤中Akt心肌保护作用的研究

摘要

目前心血管疾病是当今人类导致死亡的主要原因之一，心肌缺血-再灌注损伤（I/R）是临床中常见的组织器官损伤，但其机制尚不十分明晰。研究表明多种生长因子对心肌细胞均有保护作用，使其免受局部缺血及其他损伤带来的损害。虽然这些心肌保护因子的下游转导通路很复杂，但在很多情况下，Akt的激活是一个共同特征。Akt是细胞内重要的信号转导通路，在细胞的凋亡、存活、增值以及细胞骨架的变化等活动中发挥重要的生物学功能，特别是对细胞凋亡、存活的调节作用。　　本项研究在已有的工作基础上，进一步观察了针刺手厥阴经穴对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞内p-Akt蛋白含量的变化及离体心肌细胞培养抗凋亡作用的影响，并对其作用机制进行探讨，为今后临床研究提供理论依据。　　目的：本研究以缺血再灌注损伤大鼠模型心电图为基础，观察电针手厥阴经“内关”、“郄门”穴在缺血-再灌注损伤中对大鼠血浆Hcy、体内Akt磷酸化水平及在体、离体心肌细胞凋亡的影响，阐明Akt信号转导通路在抑制凋亡，保护心肌细胞方面的作用机理。　　方法：在体实验研究：Wistar大鼠70只，随机分为假手术组、缺血-再灌注模型Ⅰ组、缺血-再灌注模型Ⅱ组、针刺“内关”治疗组、针刺“郄门”治疗组、针刺“合谷”对照组和LY294002抑制剂组。假手术组只穿线不结扎冠状动脉，其余各组制备缺血-再灌注模型，抑制剂组在造模前尾静脉注射 LY294002抑制剂（0.3mg/kg），3个针刺穴位组分别电针大鼠“内关”穴、“郄门”穴或“合谷”穴分别各20min，结扎冠状动脉左前降支40min，心电图监测，而后再次电针上述穴位20min，松扎，恢复冠脉灌流，抑制剂组实验过程同针刺“内关”治疗组。假手术组于穿线后100min、其他各组于再灌注后60min，腹腔静脉取血并摘取心脏，观察血浆 Hcy含量、p-Akt的含量（免疫印迹法）、心肌细胞凋亡率（TUNEL法）。数据用SAS8.2统计软件由专业人员进行分析。　　离体实验研究：Wistar大鼠14只，随机分为假手术组、缺血-再灌注模型Ⅰ组、缺血-再灌注模型Ⅱ组、针刺“内关”治疗组、针刺“郄门”治疗组、针刺“合谷”治疗组和LY294002抑制剂组，各组第一部分实验同在体实验。摘取心脏后，进行第二部分实验，离体培养3h，流式细胞仪Annexin V/PI双染检测心肌细胞凋亡率。　　结果：　　1.缺血-再灌注模型Ⅰ、Ⅱ组心电图 ST段均抬高明显，与针刺“内关”治疗组、针刺“郄门”治疗组及LY294002抑制剂组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；“合谷”组ST段变化趋势与模型组近似，无显著性差异（P＞0.05）。　　2.与假手术组比较，模型Ⅰ、Ⅱ组、“合谷”组及抑制剂组大鼠血浆Hcy含量明显提高（P<0.01）；与模型Ⅰ组比较，模型Ⅱ组血浆Hcy含量无明显差异（P＞0.05），“内关”组、“郄门”组和抑制剂组血浆Hcy含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。与“内关”组比较，“郄门”组血浆Hcy含量无明显差异（P＞0.05），模型Ⅰ组、模型Ⅱ组、“合谷”组及LY294002抑制剂组血浆Hcy含量明显高于针刺“内关”组，差异有统计学意义（P<0.01）。　　3.与假手术组比较，两模型组、“合谷”组及抑制剂组大鼠心肌组织p-Akt含量明显降低（P<0.01）；“内关”组、“郄门”组 p-Akt含量与假手术组比较亦出现差异（P<0.05）；与模型Ⅰ组比较，模型Ⅱ组、“合谷”组p-Akt含量无明显差异（P＞0.05）；“内关”组、“郄门”组p-Akt含量与模型Ⅰ组比较升高明显（P<0.01）；抑制剂组p-Akt含量升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与“内关”组与“郄门”组间比较p-Akt含量无明显差异（P＞0.05），模型Ⅰ组、模型Ⅱ组、“合谷”组及抑制剂组p-Akt含量均明显低于“内关”组，差异有统计学意义（P<0.01）。　　4.与假手术组比较，两模型组、“合谷”组及抑制剂组大鼠心肌组织细胞凋亡率明显升高（P<0.01）。“内关”组、“郄门”组心肌细胞凋亡率与模型Ⅰ、Ⅱ组比较有明显降低（P<0.01）；抑制剂组大鼠心肌组织细胞凋亡率降低（P<0.01）；“合谷”组凋亡率呈上升明显，差异有显著的统计学意义（P<0.01）。与“内关”组比较，模型ⅠⅡ组、“合谷”组及抑制剂组，差异有统计学意义（P<0.01）；“内关”组与“郄门”组比较凋亡率无明显差异（P＞0.05）。　　5.与假手术组相比，其余各组离体心肌细胞早期凋亡率和晚期凋亡率呈升高趋势；“内关”组、“郄门”组、抑制剂组早期凋亡率低于两模型组和“合谷”组；“内关”组、“郄门”组晚期凋亡率低于两模型组和对照组。抑制剂组晚期心肌细胞凋亡率介于模型Ⅰ、Ⅱ组之间，高于“内关”组和“郄门”组。　　结论：　　1.针刺手厥阴经穴可有效抑制Hcy的含量，降低心肌细胞的损伤。　　2.针刺可促使心肌细胞p-Akt蛋白表达水平明显提高，说明在缺血-再灌注过程中激活了PI3K/Akt信号通路，磷酸化Akt含量增加，从而减轻了心肌缺血-再灌注损伤程度，发挥了保护心肌的作用。　　3.针刺“内关”、“郄门”穴后，大鼠心肌细胞凋亡率明显下降，LY294002抑制剂组心肌细胞凋亡率要明显高于“内关”组，说明针刺在激活Akt信号转导通路的同时，有效抑制了心肌细胞的凋亡。　　4.在离体心肌细胞培养中，“内关”组、“郄门”组心肌细胞凋亡率呈下降趋势，LY294002抑制剂组凋亡率明显高于“内关”组，说明针刺的保护作用在细胞培养的离体实验中依然存在。

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引言

第一部分 在体实验研究

1 材料与方法

2 结果

3讨论

第二部分 离体实验研究

1 实验动物及分组

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

全文小结

结论

参考文献

附A 综述：Akt与心肌保护的研究进展

附B 综述：针刺作用与Akt激活对缺血再灌注损伤心肌保护作用的比较分析

致谢

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