构建铁皮石斛多维指纹图谱方法的研究

摘要

铁皮石斛为兰科石斛属植物，是一种名贵的药用植物。由于铁皮石斛特殊的生长环境和人们的过度采挖，目前铁皮石斛的野生资源已日趋枯竭，市场资源十分混乱。为促进该产业的健康发展，本文构建了铁皮石斛毛细管电泳指纹图谱、SRAP分子指纹图谱和多糖指纹图谱。 (1)毛细管电泳指纹图谱的构建：通过对提取条件和检测条件的优化，发现以40mM硼砂(pH9.5，含5％甲醇)为运行缓冲液，以20％乙醇为提取溶剂，能从10种产地铁皮石斛中得到15个特征指纹峰，并以第9号峰为内参比峰，计算各峰的相对保留时间和相对峰面积可作为指纹信息。在此基础上，对不同产地铁皮石斛药材进行了相似度分析、主成分分析、系统聚类分析，10种产地铁皮石斛可以被分为三类：浙江温州、浙江雁荡山、浙江富阳、江西、云南、广西、广东产地铁皮石斛聚为第一类，福建、安徽产地铁皮石斛聚为第二类，湖南产地铁皮石斛聚为第三类。此外，采用逐步判别法选取四个特征指纹峰面积(X<,2>、X<,7>、X<,11>、X<,13>)为原始数据，构建其典型判别函数，将待分类样品6个特征指纹峰的相对峰面积代入上述方程即可算出其所属类别。 (2)DNA分子指纹图谱的构建：通过对SRAP-PCR反应体系的优化，确立了铁皮石斛SRAP-PCR最佳反应体系：模板DNA30ng，dNTP0.25 mM，引物浓度0.1μM，Mg<'2+>浓度2.0 mM，Taq DNA聚合酶1.5 U，10×PCR Buffer 2.5μL，总反应体积为25μL。用四对引物组合对七种产地铁皮石斛进行扩增，共得到77条带，其中特异性分子标记39个，多态率达51％。四对引物中，Me5-Em6组合具有较多的多态性位点，Rp值也较高。遗传距离和系统聚类分析结果表明：七种产地铁皮石斛被分为四类，浙江温州、广东、广西为第一类；湖南为第二类；浙江雁荡山，江西为第三类；云南为第四类。 (3)多糖指纹图谱的构建：采用荧光辅助糖电泳技术构建了铁皮石斛多糖的酶解指纹图谱。多糖经β-甘露聚糖酶和纤维素酶分别水解，产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，发现不同产地铁皮石斛中聚合度较高寡糖片段位置和荧光强度有一定的差别，且β-甘露聚糖酶产生的多态性高于纤维素酶。按上述方法，对七种不同品种石斛多糖进行分析，发现高聚合度的片段与低聚合度的片段之间差异比较明显，且纤维素酶所产生的多态性要高于β-甘露聚糖酶。 研究结果不仅为铁皮石斛种质资源鉴定提供理论依据，而且能为进行中药材质量评价的研究提供方法学参考。

目录

文摘

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论文说明：图表目录

声明

致谢

1前言

1.1中药指纹图谱的研究进展

1.2药用石斛种质鉴定研究

1.3本论文研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.2主要试剂

2.3主要仪器

2.4铁皮石斛毛细管电泳指纹图谱的构建

2.4.1样品溶液的制备

2.4.2电泳条件的选择

2.5铁皮石斛SRAP分子指纹图谱的构建

2.5.1石斛基因组DNA的提取

2.5.2 PCR体系、程序与检测

2.5.3试验设计

2.6铁皮石斛多糖指纹图谱的构建

2.6.1石斛多糖的提取和纯化

2.6.2单糖和寡糖的ANTS衍生化

2.6.3石斛多糖的酶解

2.6.4寡糖标尺的构建

2.6.5多糖的全水解

2.6.6 ANTS衍生物的电泳分离

3结果与分析

3.1构建铁皮石斛的毛细管指纹图谱方法的研究

3.1.1电泳条件的选择

3.1.2铁皮石斛毛细管电泳指纹图谱的建立

3.2构建铁皮石斛的SRAP分子指纹图谱方法的研究

3.2.1铁皮石斛SRAP-PCR反应体系的优化

3.2.2 7种铁皮石斛样品之间的SRAP多态性分析

3.2.3不同石斛样品之间的SRAP多态性分析

3.3构建铁皮石斛的多糖指纹图谱方法的研究

3.3.1糖的衍生化

3.3.2不同的电泳条件对分离效果的影响

3.3.3荧光辅助糖电泳构建铁皮石斛多糖指纹的研究

3.3.4不同种石斛多糖酶切指纹图谱的比较

3.3.5荧光辅助糖电泳对铁皮石斛多糖结构的一些研究

3.3.6建立荧光辅助糖电泳方法的技术探讨

4.结论

参考文献