慢病毒转染胸苷磷酸化酶基因增强5'-脱氧氟尿苷抗人结肠癌细胞活性

摘要

背景：胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）是嘧啶核苷合成和分解过程中的一个关键酶。目前认为 TP与血小板源性内皮细胞生长因子（platelet-derived endothelial cell growthfactor，PD-ECGF）具有同源性，其诱导血管形成和抗凋亡的作用与结直肠癌的生长、转移密切相关。同时 TP也是使5’-脱氧氟尿苷（5’-deoxy-5-fluorouridine，5’-DFUR）等5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）前体药物转化为5-FU的关键酶，其活性与结直肠癌细胞对氟尿嘧啶类药物的敏感性及靶向治疗密切相关。因此TP在肿瘤的生长、转移、治疗和预后方面均有重要作用。近年来，关于结直肠癌及转移组织中表达TP的具体部位报道各异。我们前期研究发现在人结直肠癌组织中及肝转移组织中的TP主要由间质细胞表达，尤其是肿瘤相关巨噬细胞（Tumor associated macrophages，TAM）；同时，研究表明IFN-α2a可上调人结肠癌细胞LOVO和SW480中TP的mRNA表达水平，提示临床上可通过应用这些细胞因子增强5’-DFUR的化疗效果。慢病毒载体（Lentiviral vector，LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它既可感染分裂细胞，也可感染非分裂细胞，如神经细胞、造血干细胞、肝细胞等，还具有整合到宿主细胞基因组、稳定长效转染、感染效率高等优点，能高效将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系，得到稳定转染的新细胞系，并且稳定表达目的基因翻译的蛋白。因此，近年来越来越多的学者开始利用慢病毒载体将目的基因转至宿主细胞，以获得TP高表达的人结肠癌细胞株。本实验采用慢病毒为载体将TP基因转入结直肠癌细胞株中，探讨转染TP cDNA至人结肠癌细胞后的转染效率，同时检测转染前后5’-DFUR对结肠癌细胞株HT29和LS174T的IC50的变化，以及转染前后细胞培养基和细胞裂解液中癌细胞转化5’-DFUR为5-FU的量的变化。　　目的：利用慢病毒载体将胸苷磷酸化酶（TP）基因转染人结肠癌细胞株 HT29和LS174T，构建稳定传代的高TP表达细胞株。检测5’-DFUR和5-FU对2种细胞株转染TP基因前后抗癌效应的改变。　　方法：构建包含TP基因的慢病毒载体，转染人结肠癌细胞株HT29和LS174T。传代5代后以流式细胞技术和免疫荧光法检测转染效率；然后对2种细胞株转染TP基因前后的如下指标进行检测：抗TP抗体免疫组织化学染色及Western blot对TP蛋白表达进行定性检测；RT-PCR法检测TP的mRNA改变；MTS法检测5’-DFUR和5-FU的在转染TP基因前后的半数抑制浓度（IC50）的变化；高效液相色谱（HPLC）法检测2种细胞株转染TP基因前后转化5’-DFUR为5-FU的量的变化。　　结果：转染TP基因的HT29-TP与LS174T-TP传代5代后，转染效率稳定在95％左右。免疫组织化学染色及Western blot提示转染TP基因后HT29-TP与LS174T-TP的TP蛋白表达明显增强，TP的mRNA表达也分别比野生型细胞增加了8.45倍和2615.02倍（P＜0.01）。5’-DFUR和对HT29的IC50由转染TP基因前的707.66μmol/L降到转染后的14.33μmol/ L（P<0.01），对LS174T的IC50则由转染TP基因前的239.20μmol/L降到转染后的0.59μmol/L（P<0.01）。5-FU对HT29和LST174T的IC50也分别从转染TP基因前的14.19μmol/L和16.41μmol/L降到5.42μmol/L和4.41μmol/L（P<0.01）。HPLC发现转染 TP基因的HT29-TP与LS174T-TP在含有不同浓度的5’-DFUR的培养基中生成的5-FU的量明显多于野生型细胞，分别增加了12.2~28.7倍和13.1~23.6倍；仅携带慢病毒载体的培养基中检出的5-FU与野生型细胞则无明显改变。转染TP基因的2种细胞株裂解液中也分别检出少量转化的5-FU，但在野生型细胞和仅携带慢病毒载体细胞的裂解液中则无5-FU检出。　　结论：以慢病毒为载体将TP基因转染至人结肠癌细胞HT29和LS714T，能得到转染效率高及稳定传代的细胞株，其TP蛋白表达及TP mRNA表达均明显增高。转染后在培养基中转化的5-FU含量明显增高，使5’-DFUR对HT29和LS714T的抗癌作用明显增强。

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英文摘要

前言

材料与方法

1. 材料

1.1 细胞系

1.2TP cDNA和慢病毒载体

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

2. 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 慢病毒载体的构建、包装与滴度的检测

2.3 慢病毒载体介导的基因转染

2.4Western blot法检测转染前后细胞TP蛋白表达

2.5 免疫组织化学染色（二步法）检测转染前后细胞TP蛋白表达

2.6RT-PCR法检测转染前后细胞TP mRNA表达

2.7 MTS法检测 5-FU 及 5’-DFUR 对转染前后细胞的抑制作用

2.8 HPLC法检测转染前后细胞转化 5’-DFUR 为 5-FU 的能力

2.9 统计学分析

结果

1、TP cDNA转染细胞相关结果

2、转染前后细胞TP蛋白的表达水平

3、免疫组织化学染色法检测转染前后细胞TP蛋白的阳性结果

4、RT-PCR法检测转染前后细胞TP基因的相对表达量

5、转染TP基因前后各细胞株对5-FU及5’-DFUR敏感性的变化

6、转染TP基因前后各细胞株转化5’-DFUR为5-FU的能力比较

讨论

结论

参考文献

文献综述

致谢

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