miR-205-5p在乙肝病毒相关肝病患者血清中表达及其功能研究

摘要

背景和目的：乙肝病毒相关性肝病主要包括急慢性乙型肝炎，乙肝后肝硬化，乙肝相关性肝癌等。从疾病发生发展角度来说，HBV感染引起的慢性乙肝、乙肝后肝硬化是导致肝细胞癌形成最主要因素。肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌，是目前世界上癌症相关死亡的第三大原因，每年有超过50万的癌症患者死于肝细胞癌，而导致肝癌死亡率高预后差的原因之一是无法早期诊断。当前AFP检测是肝癌筛检最常用方法，研究表明急性肝炎、肝硬化患者亦可出现AFP升高的现象，另外，大约有30%的肝癌患者AFP阴性。因此，寻找新的灵敏度和特异度更好的肝细胞癌生物学标记物很有必要。microRNA(miRNA)是一类约22nt的内源性非编码单链小分子RNA，通过与靶标mRNA不完全互补配对而裂解mRNA或抑制翻译起始，对细胞分裂周期的调控、DNA损伤的修复、肿瘤微环境的调控、肿瘤血管生成、免疫应答的调控等诸多生物学过程进行调节[1-3]。研究发现：血清中miR-205表达的改变可在一定程度上反映疾病的状态，是疾病诊断与预后判断的潜在指标。例如，miR-205与肿瘤标记物（CA-125）联合检测提高了卵巢癌诊断的特异性[4]，miR-205-5p在非小细胞肺癌患者血清中的表达量显著高于其他类型的肺癌并与肺癌患者临床治疗效果及预后有密切相关性[5]。尽管有研究表明miR-205-5p在乙肝相关性肝癌组织中表达水平下降[6]，但miR-205-5p在血清中的相对表达量仍未有相关报道。近期有研究表明miR-205可以抑制HepG-X肝癌细胞增殖，但是抑制细胞增殖的具体机制并不完全清楚。另外，有文献显示，miR-205在肝癌细胞（SMCC7721)中表达量明显上调，但该研究未报道miR-205对肝癌细胞的增殖、周期、凋亡、迁移等生物学特性的影响。　　鉴于此，本研究探讨乙肝病毒相关肝病患者血清中miR-205-5p的表达水平与血清HBV-DNA、AFP定量水平的关系，分析血清miR-205-5p与HBV相关肝癌患者临床病理参数的关系，评估血清miR-205-5p能否作为乙肝相关肝癌早期诊断及预后监测的分子标记物。并运用瞬时转染的方法，使HepG2.2.15肝癌细胞中的miR-205-5p过表达，观察miR-205-5p对HepG2.2.15肝癌细胞增殖、周期及周期调控分子E2F1基因与HBx基因的影响，为miR-205-5p参与乙肝相关肝癌发生发展的分子机制提供依据，为抗病毒治疗与乙肝相关性肝癌的靶向治疗打下基础。　　方法：1、检测血清中miR-205-5p的相对表达量　　（1）根据2010年版病毒性肝炎防治方案诊断标准，收集34例乙肝相关肝癌患者、慢性肝病患者41例、19例健康体检者的血清样本共94例及相应临床病历资料，应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测血清中miR-205-5p的相对表达水平，分析miR-205-5p在各组之间的表达差异，应用受试者工作曲线（ROC）曲线分析miR-205-5p用于乙肝相关肝癌的诊断价值；　　（2）采用化学发光法检测乙肝相关肝癌患者血清AFP，采用荧光定量PCR技术检测HBV相关肝癌患者血清HBV-DNA含量，对血清miR-205-5p与AFP、HBV-DNA进行相关性分析。　　2、观察miR-205-5p对HepG2.2.15细胞增殖、周期的影响　　（1）应用瞬时转染的方法，将miR-205-5p mimics转染到HepG2.2.15细胞中，转染后通过荧光显微镜下观察效果及荧光定量PCR测定HepG2.2.15中miR-205-5p的含量确定转染效率。　　（2）利用CCK-8试剂处理转染miR-205-5p mimics后的HepG2.2.15细胞，检测miR-205-5p对HepG2.2.15细胞增殖的影响。流式细胞仪检测miR-205-5p对HepG2.2.15细胞周期的影响。　　3、观察miR-205-5p对E2F1基因表达的影响　　通过荧光定量PCR的方法检测miR-205-5p mimics转染后HepG2.2.15细胞中E2F1mRNA的影响，同时，免疫印迹法（western blot）检测HepG2.2.15细胞中E2F1蛋白的含量。　　4、观察miR-205-5p对HBx基因表达的影响　　采用荧光定量PCR的方法检测miR-205-5p mimics转染后HepG2.2.15细胞中HBxmRNA的表达量，用ELISA的方法检测HBx蛋白（HBxAg）的含量。　　结果：1.HBV相关肝癌患者血清miR-205-5p表达水平低于健康对照组与慢性肝病组(P＜0.05)。慢性乙肝患者血清中miR-205-5p表达量与乙肝肝硬化患者血清中miR-205-5p表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。　　2.HBV相关肝癌患者中不同年龄、性别、肿瘤大小、癌栓之间，血清miR-205-5p表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。乙肝相关肝癌患者血清miR-205-5p相对表达量与患者血清HBV-DNA含量无相关性（r=0.239，p＞0.05）；乙肝相关肝癌患者血清miR-205-5p相对表达量与患者血清AFP含量无相关性（r=0.315，p＞0.05）。　　3.ROC曲线分析显示：血清miR-205-5p区分HBV相关肝癌患者与正常对照的AUC值为0.812（95%CI：0.681~0.906，P＜0.05），截断值为1.01时，敏感度与特异度分别为79.4%与73.7%；血清miR-205-5p区分HBV相关肝癌患者与慢性肝病的AUC值为0.747（95%CI：0.633~0.840，P＜0.05），截断值为0.83时，敏感度与特异度分别为64.7%与73.2%。　　4.普通光镜下可见HepG2.2.15细胞呈梭形，抱团生长；荧光显微镜下HepG2.2.15细胞胞浆内均有红色荧光表达，细胞形态清晰，表明转染效果较好。转染48h后，实验组、阴性对照组（NC组）、空白对照组miR-205-5p相对表达量分别为179.25±5.71、1.02±0.26、1.01±0.24。实验组miR-205-5p相对表达量较NC组、空白对照组的miR-205-5p相对表达水平均明显升高（P＜0.05），说明在细胞中成功上调miR-205-5p表达。　　5.与空白对照组、阴性对照组（NC组）比较，实验组转染miR-205-5p mimics24、48、72小时后细胞增殖活性被抑制；转染48h后，实验组中G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例下降（P＜0.05）。　　6.转染48h后，实验组HepG2.2.15细胞中E2F1mRNA相对表达量为（0.38±0.05），均比NC组（1.07±0.19）与空白对照组（1.01±0.18）表达量下降；实验组E2F1蛋白表达水平较阴性对照组、空白对照组减低（P＜0.05）。　　7.转染48h后，实验组HepG2.2.15细胞中HBx mRNA相对表达量为（0.29±0.05），均比NC组（0.91±0.18）与空白对照组（1.00±0.07）表达量下降（P＜0.05）；实验组上清液中HBxAg在450nm处吸光值为（0.64±0.09）比NC组（1.04±0.19）和空白对照组（1.06±0.16）相应的吸光值均减低（P＜0.05）。　　结论：1.miR-205-5p在HBV相关肝癌患者血清中表达低于慢性肝病患者、健康对照者，有可能成为一种新的HBV相关肝癌诊断的分子标记物。　　2.上调miR-205-5p可抑制HepG2.2.15肝癌细胞增殖，并导致HepG2.2.15肝癌细胞周期阻滞。　　3.上调miR-205-5p可抑制HepG2.2.15肝癌细胞中E2F1基因表达。　　4.上调miR-205-5p可抑制乙肝病毒X基因表达。

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