油田水样微生物群落结构分析及原油降解工程菌的构建和特性研究

摘要

我国是一个能源消耗大国，石油供需严重不平衡，已经成为制约我国国民经济发展的重要因素之一。然而，由于各种原因，采油过程中都会有石油烃类的溢出和大量含油废水排放，造成水体和土壤严重的污染。因此，油田生产迫切需要能够提高采油效率以及减少污染排放的清洁生产技术。微生物采油技术(MEOR)利用环境中微生物对原油的作用提高石油产量，具有消耗低、无二次污染等优点，是目前广受关注的减污降耗的油田清洁生产技术。而对油田环境中原本存在的“本源”微生物群落的解析和调控是研究、开发和利用该技术的关键。同时构建原油高效降解菌群，也为提高采油效率和高效处理含油废水奠定了技术基础。 本研究采用分子生物学方法T-RFLP和克隆文库分析方法对来自某采油厂的三个区块(联合站，注入井，油井)的污水样和油井采出液样品中的微生物群落结构进行了分析，发现三个区块水样中的细菌群落T-RFLP图谱相似性比较低，说明其群落结构差异很大，同一个区块不同取样点的细菌群落结构差异也较大，细菌的优势种群也各不相同，其细菌群落主要有四个类群：变形杆菌(proteobacteria)，拟杆菌(Bacteroidetes)，脱铁杆菌(Deferribacteres)，以及未确定分类的类群：而在水样古菌群落结构方面，不同区块的古菌群落结构有着明显的差异。同一区块古菌群落结构相对稳定，来自同一地层环境的样品相似性很高，古菌赖以生存的某种特定极端环境条件是决定其群落结构的主要因素。通过利用T-RFLP的方法对油藏中的微生物群落结构进行分析监控，可以避开微生物传统培养方法的各种缺陷，从而更客观准确的掌握油藏土著微生物的种类数量及其在群落中的分配比例，然后为以后按比例构建混合菌剂，进行外源投加，从根本上刺激提高采油微生物的数量和活性提供可靠的理论基础和技术支持。同时，也为以后筛选构建高效原油降解菌群，解决石油污染生物治理问题奠定了良好的理论基础。本次研究还通过电转化的方法将含有原油降解功能基因Lys的质粒PKsphi1-2通过电击导入宿主菌S25A1的感受态中，构建出一株具有原油降解功能的基因工程菌PKS25A1。通过原油降解试验，对其原油降解功能进行鉴定。实验结果表明：该工程菌对复杂结构烷烃有较强的降解能力，为高效处理含油废水提供了理论和参数依据综上所述，通过对微生物群落结构的分析，准确的掌握土著微生物的种类和数量，不仅为后续开发和应用减污降耗的油田清洁生产技术提供了理论基础，也为筛选构建高效原油降解菌群，调控油田废水处理中微生物群落结构以及开发高效废水处理工艺提供了理论依据。而构建原油降解基因工程菌的研究，则为原油中重质成份的降解，改善原油流动性，提高采油率；进一步提高含油废水处理效率提供了可靠的技术支持。

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致谢

第一章绪论

1.1石油工业的环境问题以及油田清洁生产技术

1.1.1石油工业的环境问题

1.1.2油田清洁生产技术

1.2环境微生物群落结构分析研究概况

1.2.1环境微生物群落结构的研究方法

1.2.2 T-RFLP方法

1.3基因工程菌构建的研究概况

1.3.1基因工程菌

1.3.2基因工程菌构建

1.3.3基因工程菌的应用前景

1.4目前微生物采油技术研究存在的问题

1.5研究目的和内容

第二章实验方法和材料

2.1样品来源

2.2实验方法

2.2.1 DNA提取

2.2.2 PCR扩增反应

2.2.3酶切

2.2.4 T-RFLP分析

2.2.5克隆文库的构建

2.2.6克隆文库测序与Genbank比对

2.2.7聚类分析

2.2.8多样性指数计算

2.2.9宿主菌的选择及感受态的制备

2.2.10制备电转化质粒

2.2.11电转化

2.2.12工程菌PKS25A1中Lys基因的检测验证

2.2.13工程菌的遗传稳定性测定

2.2.14工程菌对原油的降解

第三章不同水体中细菌群落结构比较分析

3.1实验材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.2实验结果与分析

3.2.1 T-RFLP对水样微生物细菌群落结构的解析

3.2.2细菌克隆文库

3.3讨论

3.3.1不同地点和样品的细菌群落变化

3.3.2细菌在油藏水体环境中的生态地位

3.4本章小结

第四章不同水体中古菌群落结构比较分析

4.1实验材料与方法

4.1.1实验材料

4.1.2实验材料

4.2实验结果与分析

4.2.1 T-RFLP对水样微生物古菌群落结构的解析

4.2.2古菌克隆文库

4.3讨论

4.3.1不同地点和水样的古菌群落变化

4.3.2古菌在油藏水体环境中的生态地位

4.4本章小结

第五章原油降解工程菌的构建及其特性研究

5.1实验材料与方法

5.1.1实验材料

5.1.2实验方法

5.2结果与分析

5.2.1工程菌PKS25A1中质粒PKsphi1-2的遗传稳定性

5.2.2 工程菌PKS25A1中Lys基因的检测验证

5.2.3 工程菌PKS25Al对大庆原油的降解特性

5.3小结

第六章结论和建议

6.1结论

6.2建议

参考文献