从调控内质网应激探讨化痰通络方对急性脑梗死大鼠rt-PA溶栓后神经元适应性保护的机制研究

摘要

目的：　　本研究采用改良自体血栓法制备大鼠MCAO模型，以化痰通络方中药为干预手段，观察化痰通络方对急性脑梗死大鼠rt-PA溶栓后内质网应激不同激活途径关键靶点的影响，探讨中药防治急性脑梗死溶栓后缺血再灌注损伤的作用机制，为中药参与脑梗死早期溶栓治疗临床应用提供部分实验依据。　　方法：　　采用随机对照实验，雄性SD大鼠80只，适应性饲养2天，采用改良自体血栓法制备大鼠MCAO模型，模型大鼠苏醒后采用Zausinger六分法评估模型神经功能缺损，并随机分为假手术组、模型组、rt-PA组和化痰通络方联合rt-PA组，每组各20只，rt-PA组和化痰通络方联合rt-PA组在造模成功后3h，采用尾静脉注射rt-PA溶栓；化痰通络方联合rt-PA组在造模成功后以及rt-PA溶栓后22h给予化痰通络方灌胃。于模型大鼠苏醒后及造模后24h，采用Zausinger六分法评估各组大鼠神经功能；采用TTC染色观察大鼠脑组织梗死比率；采用HE染色观察梗死侧皮质神经元的形态；采用硝酸还原酶法和Elisa检测大鼠梗死侧脑组织中NO与TNF-α的含量；采用TUNEL法检测大鼠梗死侧海马神经细胞凋亡情况；采用Western blot法检测梗死区脑组织中内质网应激后保护性途径关键蛋白IRE1、PERK、ATF6和GRP78(Bip)及凋亡途径中关键蛋白CHOP(GADD153)、TRB3、Akt、JNK1、TRAF-2、ASK1、Caspase12、Caspase9和Caspase3的表达。　　结果：　　1.与假手术组比较，治疗前模型组、rt-PA组和化痰通络方联合rt-PA组Zausinger评分显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），三组组间Zausinger评分比较无统计学差异（P>0.05）；治疗后，与模型组比较，rt-PA组、化痰通络方联合rt-PA组Zausinger评分显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与rt-PA组比较，化痰通络方联合rt-PA组Zausinger评分呈升高趋势，差异无统计学意义（P>0.05），　　2.（1）TTC染色显示：假手术组可见均匀红色的正常脑组织，未见明显苍白色梗死灶，模型组、rt-PA组、化痰通络方联合rt-PA组左侧大脑半球均可见苍白色梗死灶，梗死灶与正常脑组织分界明显。与假手术组相比，模型组梗死区比率明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，rt-PA组和化痰通络方联合rt-PA组梗死区比率明显减小，差异有统计学意义（P<0.05）；与rt-PA组比较，化痰通络方联合rt-PA组梗死区比率呈下降趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。　　（2）HE染色显示：假手术组神经元密集、排列整齐，细胞胞浆丰富、着色均匀，核仁清晰可见、位于细胞中部，可见少量红色凋亡神经元；模型组神经元重度肿胀，核仁固缩，可见大部分红色凋亡神经元，神经元数量明显减少；rt-PA组和化痰通络方联合rt-PA组部分神经元中度肿胀，神经元分布稀疏、排列紊乱，可见少部分红色凋亡神经元，神经元数量减少。　　（3）硝酸还原酶法显示：与假手术组比较，模型组NO表达明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，rt-PA组NO呈降低趋势，差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，化痰通络方联合rt-PA组NO明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与rt-PA组比较，化痰通络方联合rt-PA组NO呈降低趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。　　（4）Elisa显示：与假手术组比较，模型组TNFα表达明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，rt-PA组TNFα呈降低趋势，差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，化痰通络方联合rt-PA组TNFα明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与rt-PA组比较，化痰通络方联合rt-PA组TNFα呈降低趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。　　（5）TUNEL法检测梗死侧海马神经元凋亡情况显示：与假手术组比较，模型组神经元凋亡数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，rt-PA组、化痰通络方联合rt-PA组神经元凋亡数明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与rt-PA组比较，化痰通络方联合rt-PA组神经元凋亡数明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。　　3.内质网应激保护性途径相关蛋白Western blot结果显示：与假手术组比较，模型组GRP78、IRE1、PERK和ATF6蛋白表达量显著增高；与模型组比较，rt-PA组GRP78蛋白表达量显著增高，差异具有统计学意义（P<0.05），IRE1蛋白表达量呈增高趋势、PERK和ATF6蛋白表达量呈降低趋势，差异无统计学意义（P>0.05），化痰通络方联合rt-PA组IRE1蛋白表达量呈增高趋势，差异无统计学意义（P>0.05），GRP78蛋白表达量明显增高、PERK和ATF6蛋白表达量显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；与rt-PA组比较，化痰通络方连联合rt-PA组，GRP78、IRE1表达量呈上升趋势，PERK、ATF6蛋白表达量呈降低趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。　　4.内质网应激凋亡途径相关蛋白Western Blot结果显示：与假手术组比较，模型组CHOP、TRB3、JNK1、TRAF-2、Caspase12、Caspase9和Caspase3蛋白表达量显著增高，差异具有统计学意义（P<0.05），Akt蛋白表达量显著下降，差异具有统计学意义（P<0.05），ASK1蛋白表达量呈增高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，rt-PA组和化痰通络方联合rt-PA组TRB3、JNK1、TRAF-2、Caspase12、Caspase9和Caspase3蛋白表达量显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05），Akt蛋白表达量显著增高，差异具有统计学意义（P<0.05），CHOP蛋白表达量呈下降趋势，差异无统计学意义（P>0.05），rt-PA组ASK1显著增高，差异具有统计学意义（P<0.05），化痰通络方联合rt-PA组ASK1呈增高趋势，差异无统计学意义（P>0.05）；与rt-PA组比较，化痰通络方联合rt-PA组Akt蛋白表达量显著增高，ASK1、Caspase9、Caspase3蛋白表达量显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05），CHOP、TRB3、JNK1、TRAF-2和Caspase12蛋白表达量呈下降趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。　　结论　　1.化痰通络方联合rt-PA溶栓可显著减少急性脑梗死大鼠梗死区比率，改善神经功能缺损。　　2.化痰通络方联合rt-PA溶栓可显著减轻急性脑梗死大鼠神经元水肿，减少脑组织炎性因子含量，化痰通络方可明显减少rt-PA溶栓后缺血再灌注诱发的神经元凋亡。　　3.化痰通络方减轻rt-PA溶栓后缺血再灌注损伤导致的神经元凋亡的作用机制可能与调控炎性因子以及内质网应激后细胞凋亡信号通路的活性有关。

目录

声明

英文缩略词表

前言

实验一 化痰通络方对急性脑梗死大鼠溶栓后行为学及梗死灶的影响

1材料与方法

2结果

3小结

实验二 化痰通络方对急性脑梗死大鼠溶栓后缺血再灌注炎性指标及神经元凋亡的影响

1材料与方法

2实验结果

3小结

实验三 化痰通络方对内质网应激保护性信号途径中关键靶点的影响

1材料与方法

2实验结果

3小结

实验四 化痰通络方对内质网应激后凋亡信号途径中关键靶点的影响

2实验结果

3小结

讨论

2化痰通络方治疗ACI的立论依据

3化痰通络方对急性脑梗死大鼠溶栓后神经保护作用的机制探索

4化痰通络方联合rt-PA溶栓治疗急性脑梗死的优势初探

结论

创新点

参考文献

附录

综述一：rt-PA静脉溶栓治疗急性脑梗死研究进展

综述二：内质网应激与脑缺血再灌损伤

致谢

个人简历