米根霉发酵产L-乳酸的中和剂研究及代谢通量分析

摘要

在米根霉发酵产L-乳酸过程中，一般采用CaCO3作为酸中和剂，不仅L-乳酸损失大，且环境污染严重。为降低L-乳酸生产成本，寻求替代CaCO3的新型中和剂，本文通过摇瓶发酵优化得出以CaCO3、NaOH溶液和氨水作为中和剂的最适培养基组成，通过罐发酵实验确定了CaCO3、NaOH溶液和氨水的最适中和剂浓度，并在最适浓度基础上考察了米根霉的菌体形态和发酵动力学，实现了NaOH溶液和氨水作为中和剂的半连续发酵，同时对其进行代谢通量分析。主要研究结论如下：
　　 1.通过单因素和正交试验，优化得出采用CaCO3、NaOH溶液和氨水作为中和剂时的培养基组成：(1)以CaCO3作为中和剂的最优培养基组成：葡萄糖120g/L，(NH4)2SO44.0g/L，KH2PO40.15g/L，NaH2PO40.20g/L，ZnSO4·7H2O0.22g/L，MgSO4·7H2O0.35g/L。(2)以NaOH溶液作为中和剂的最优培养基组成：葡萄糖120g/L，(NH4)2SO44.0g/L，MgSO4·7H2O0.35g/L，ZnSO4·7H2O0.22g/L，NaH2PO40.10g/L，KH2PO40.15g/L。(3)以氨水作为中和剂的最优培养基组成：葡萄糖120g/L，(NH4)2SO41.0g/L，MgSO4·7H2O0.35g/L，ZnSO4·7H2O0.22g/L，NaH2PO40.15g/L，KH2PO40.15g/L。
　　 2.NaOH溶液和氨水作为中和剂时，添加Ca2+后L-乳酸产量平均提高7.3倍；通过罐发酵得出米根霉发酵产L-乳酸的最适pH值为5.5士0.2，NaOH溶液、氨水溶液作为中和剂的最佳浓度分别为10mol/L、25％，通过摇瓶发酵试验得出CaCO3最佳浓度为60g/L；在最适NaOH溶液、氨水、CaCO3浓度基础上进行罐发酵得菌丝体小球直径分别为0.2-1.2mm、1.2-2.2mm、0.8-1.8mm，残糖分别为2.58g/L、1.37g/L、22.78 g/L，L-乳酸产量分别为74.34g/L、80.61g/L、75.80g/L，发酵强度分别为1.03g/(L·h)、1.12g/(L·h)、1.40g/(L·h)；而使用NaOH溶液和CaCO3复合中和剂、氨水和CaCO3复合中和剂时发酵强度皆为1.18 g/(L·h)，高于NaOH溶液、氨水的发酵强度，低于CaCO3的发酵强度。
　　 3.在米根霉半连续发酵过程中，使用NaOH溶液作为中和剂时，L-乳酸平均发酵强度为1.53 g/(L·h)，以氨水作为中和剂时，L-乳酸平均发酵强度为1.65g/(L·h)，高于分批发酵的产酸强度。
　　 4.简单构建了米根霉As3.819胞内代谢网络模型。应用代谢通量分析法，分别以10mol/LNaOH溶液、25％氨水、60g/LCaCO3作为中和剂时不同发酵阶段胞内代谢通量分布的变化。以NaOH溶液为中和剂，第12h、36h、60h产物L-乳酸的流量速率分别为0.93mmol/g/h、2.05mmol/g/h和5.83mmol/g/h；以氨水为中和剂时，第12h、36h、60h产物L-乳酸的流量速率分别为1.48mmol/g/h、2.02mmol/g/h、5.94mmol/g/h；以CaCO3作为中和剂，第12、30h、48h产物L-乳酸的流量速率分别是10.54mmol/g/h、4.72mmol/g/h、7.30mmol/g/h。

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致谢

第一章绪论

1.1乳酸的结构与理化性质

1.2乳酸的生产方法

1.2.1发酵法

1.2.2化学合成法

1.2.3酶法

1.2.4乳酸生产方法的比较

1.3 L-乳酸的应用

1.3.1食品工业中的应用

1.3.2在医药工业中的应用

1.3.3在农业方面的应用

1.3.4在化学工业方面的应用

1.4国内外发酵生产L-乳酸的研究现状

1.4.1米根霉菌种选育方面的研究

1.4.2米根霉发酵产L-乳酸的研究现状

1.5代谢工程

1.6本论文研究目的、意义及主要内容

1.6.1研究目的和意义

1.6.2主要研究内容

第二章不同中和剂条件下发酵产L-乳酸的培养基条件优化

2.1材料与方法

2.1.1菌种

2.1.2试剂

2.1.3主要设备

2.1.4培养基

2.1.5培养方法

2.1.6检测方法

2.2实验方案

2.2.1以CaCO3作为中和剂的培养基优化

2.2.2以NaOH溶液作为中和剂的培养基优化

2.2.3以氨水作为中和剂的培养基优化

2.3结果与讨论

2.3.1以CaCO3作为中和剂

2.3.2以NaOH作为中和剂

2.3.3以氨水作为中和剂

2.4本章小结

第三章不同中和剂条件下发酵产L-乳酸的工艺条件研究

3.1材料与方法

3.1.1菌种

3.1.2试剂

3.1.3主要设备

3.1.4培养基

3.1.5培养方法

3.1.6检测方法

3.2实验方案

3.2.1 pH值对米根霉菌体生长影响的研究

3.2.2中和剂浓度对L-乳酸产量的影响

3.2.3中和剂对米根霉菌体形态的影响

3.2.4米根霉发酵产L-乳酸动力学研究

3.2.5半连续发酵试验方法

3.3结果与讨论

3.3.1最适pH值确定

3.3.2中和剂浓度对L-乳酸产量的影响

3.3.3中和剂对菌体形态的影响

3.3.4单一中和剂的发酵动力学

3.3.5复合中和剂的发酵动力学

3.3.6不同中和剂的半连续发酵

3.4本章小结

第四章不同中和剂条件下发酵产L-乳酸的代谢通量分析

4.1米根霉菌体代谢网络的建立

4.2材料与方法

4.2.1菌种

4.2.2试剂

4.2.3主要设备

4.2.4培养基

4.2.5培养方法

4.2.6检测方法

4.3结果与讨论

4.3.1以NaOH溶液作为中和剂的代谢通量分析

4.3.2以氨水作为中和剂的代谢通量分析

4.3.3以CaCO3作为中和剂时的代谢通量分析

4.4本章小结

第五章结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献