基于小肠免疫研究霍山石斛多糖预防CCL4致急性肝损伤的机制

摘要

霍山石斛是一种名贵中草药，多糖是其主要活性成分之一。有研究表明口服霍山石斛多糖有调节免疫、防治肝损伤和肝纤维化的功效，而且其免疫调节和保肝活性之间有一定的相关性。但是经口服的霍山石斛多糖发挥免疫调节和保肝活性的作用机制以及其免疫调节与保肝活性之间的内在联系尚不明确。
　　随着免疫学的不断发展，人们发现肠道中存在着大量的免疫组织和免疫细胞，这些免疫组织和免疫细胞构成了动物体最大的免疫器官--肠道粘膜相关免疫系统(GALT)，GALT可以通过血液和淋巴循环与肝脏、脾脏等其他免疫组织进行物质交换和信息交流。因此我们猜测经口服的霍山石斛多糖首先激活GALT，激活了的GALT通过血液和淋巴循环作用于肝脏和脾脏，间接实现调节肝脏和脾脏免疫的作用，同时我们猜测霍山石斛多糖的保肝作用也是以其对肝脏的免疫调节作用为基础的，本论文的目的就是验证这些假设。
　　口服霍山石斛多糖DHP15天后，从各实验组中随机取5只小鼠测定其肠道、肝脏和脾脏的相关免疫指标，分析经口服的DHP对肠道、肝脏和脾脏的免疫调节作用以及其肝脾免疫调节作用与肠道免疫调节作用之间的关系。实验结果表明口服DHP有调节肠道粘膜相关免疫系统、肝脏免疫和脾脏免疫的作用，并呈剂量依赖性；DHP被三氟乙酸全水解后丧失了免疫调节活性，说明DHP是以大分子形式发挥肠道、肝脏和脾脏免疫调节活性的；口服淀粉和右旋糖苷均无调节肠道、肝脏和脾脏免疫的活性，说明DHP的免疫调节活性具有结构特异性。用20 mgkg-1的氨甲叶酸抑制肠道免疫后，模型组和DHP低剂量组小鼠的肠道免疫组成细胞分泌促骨髓细胞增殖细胞因子的能力显著低于对照组，肝脾细胞增殖能力与对照组相比没有显著差异；DHP中剂量组小鼠的肠道免疫组成细胞分泌促骨髓细胞增殖细胞因子的能力、肝脾细胞增殖能力与对照组相比均没有显著差异；DHP高剂量组小鼠的肠道免疫组成细胞分泌促骨髓细胞增殖细胞因子的能力、肝脾细胞增殖能力均显著高于对照组，以上结果表明DHP对肝脏和脾脏的免疫调节作用在一定程度上依赖于对肠道粘膜相关免疫系统的调节作用。相关性分析结果显示，DHP调节肠道免疫的作用与调节肝脏免疫的作用间相关系数R2肠肝=0.9353，调节肠道免疫的作用与调节脾脏免疫的作用间相关系数R2肠脾=0.9463，具有较高的相关性。
　　各实验组剩余的5只小鼠用CCl4诱导急性肝损伤，分析DHP的保肝作用以及其保肝作用与肝脏免疫调节作用之间的关系。实验结果表明口服DHP有预防CCl4诱导急性肝损伤的作用，并呈剂量依赖性。用20 mgkg-1的氨甲叶酸处理后，模型组、DHP低剂量组和DHP中剂量组小鼠血清中ALT、AST活性、肝脏中MDA含量和SOD活性与溶剂组相比没有明显差异；DHP高剂量组小鼠血清中ALT、AST活性、肝组织中MDA含量显著低于溶剂组，肝组织中SOD活性显著高于溶剂组，以上结果表明DHP预防CCl4诱导急性肝损伤的作用在一定程度上依赖于其对肝脏免疫的调节作用。相关性分析结果显示DHP预防CCl4诱导急性肝损伤的作用与肝脏免疫的调节作用间相关系数R2肝肝=0.9359，具有较高的相关性。
　　DHP单糖组成分析显示DHP主要由木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖四种单糖按照1.785:16.513:1:4.216的比例组成，不同于已报道的具有肠道免疫调节活性多糖的单糖组成，表明DHP可能具有一种新的调节肠道免疫的活性结构。

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第一章 前言

1.1 肠道粘膜相关免疫组织

1.1.1 派伊尔氏结

1.1.2 肠系膜淋巴结

1.1.3 孤立淋巴滤泡

1.1.4 固有层内淋巴细胞

1.1.5 小肠上皮内淋巴细胞

1.2 肠道粘膜相关免疫组织与机体其它免疫组织的关系

1.3 肠道粘膜相关免疫与疾病的关系

1.4 具有肠道粘膜相关免疫调节活性的多糖结构

1.5 现已发现的霍山石斛多糖的生物学功能及相关问题的提出

1.6 本课题要解决的问题及其意义

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器

2.4 实验方法

2.4.1 霍山石斛多糖DHP的提取

2.4.2 霍山石斛多糖DHP的初步纯化

2.4.3 霍山石斛多糖DHP水分的测定

2.4.4 霍山石斛多糖DHP碳水化合物含量的测定

2.4.5 霍山石斛多糖DHP中可溶性蛋白含量的测定

2.4.6 霍山石斛多糖DHP灰分含量的测定

2.4.7 霍山石斛多糖糖醛酸含量的测定

2.4.8 霍山石斛多糖的单糖组成分析

2.4.9 霍山石斛多糖免疫调节活性的测定

第三章 结果与分析

3.1 霍山石斛多糖DHP理化性质的测定

3.1.1 霍山石斛多糖DHP的组成成分分析

3.1.2 霍山石斛多糖DHP的单糖组成分析

3.1.3 霍山石斛多糖DHP的红外光谱分析

3.2 霍山石斛多糖DHP对小肠粘膜相关免疫组织的调节作用

3.3 霍山石斛多糖通过小肠粘膜相关免疫组织对肝、脾等免疫组织的调节作用

3.3.1 细胞增殖测定结果

3.3.2 不同实验组小鼠体重增加的结果

3.3.3 试验用氨甲叶酸剂量不同时间对脾脏免疫的影响

3.3.4不同实验组小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞分泌细胞因子的ELISA测定结果和RT-PCR测定结果

3.3.5 不同实验组小鼠肝、脾指数的测定结果

3.3.6 肠道免疫与肝脏免疫和脾脏免疫之间的相关性分析

3.3.7 霍山石斛多糖DHP低剂量组和霍山石斛多糖DHF'高剂量加氨甲叶酸组一些指标的比较

3.4 霍山石斛DHP依赖于肝脏免疫调节的保肝作用

3.4.1 各个实验组肝损伤常规生化指标的测定

3.4.2 各个实验组肝损伤病理切片结果

3.4.3 各个实验组小鼠肝组织表达TNF-α的免疫组化结果

3.4.5 肝脏免疫与肝损伤和肠道粘膜相关免疫与肝损伤之间的相关性分析

3.4.6 不同实验组小鼠血清中LPS含量的测定结果

讨 论

参考文献

攻读硕士期间发表的论文