维生素K2高产菌株的选育及其生物合成相关基因表达丰度的研究

摘要

维生素K2是一种重要的生理活性物质，在凝血和骨骼代谢中都有重要的作用，近年随着研究的深入，维生素K2对抗肿瘤抗肝癌有显著疗效，在医药等方面应用更加广泛。传统的化学合成较为繁琐且产量不高，本文采用诱变和原生质体电融合选育维生素K2(MK)高产菌株并对其生物合成相关基因的表达丰度进行了研究，结论如下：
　　(1)实验以枯草芽孢杆菌BS-5为出发菌株，采用紫外和NTG相结合的方法连续诱变处理3代，经抗性平板初筛和摇瓶复筛后，获得了一株高产MK的突变菌株BS-53，其产量较原始菌株BS-5提高了90.5%，达到19.85mg/L，是原始菌株的1.9倍。经25次传代实验后，表明菌株BS-53产MK的能力具有遗传稳定性，BS-53菌株摇瓶液体发酵优化培养基为：甘油5%，大豆提取物3%，酵母粉0.6g/L、，K2HPO40.3mol/L、CaCl2·2H2O0.1g/L、MgSO4·7H2O0.3g/L。
　　(2)对在实验过程中影响原生质体形成率和再生率的各种因素进行研究。结果表明酶浓度、酶解时间、酶解温度、pH值、渗透压稳定剂、青霉素预处理、同步培养等对原生质体形成和再生有较大影响，在对每个因素做单因素实验的基础上，确定了诱变菌株BS-53原生质体形成和再生的最优条件是：4℃保温2h同步培养，0.6U/ml的青霉素预处理2h，离心收集菌体后置于pH为7.5的甘露醇溶液，加入1.4mg/ml的溶菌酶37℃酶解40min，此条件下原生质体制备率为97.6%，再生率为26.3%。菌株CICC10262的最优条件是：4℃同步培养2h，2.0U/ml的青霉素预处理2h，离心收集菌体后置于pH为7.5的甘露醇溶液，加入1.0mg/ml的溶菌酶37℃酶解60min，原生质体制备率为98.3%，再生率为24.3%。
　　(3)实验采用双亲灭活原生质体电融合选育MK高产菌株，探究了灭活和电融合条件。结果表明：亲本菌株经热灭活和紫外灭活后，在成串脉冲频率2MHz，成串电压32V，脉冲融合电压500V，脉冲宽度40μs，脉冲个数6个的条件下进行电融合，筛选得到一株优良菌株BKU-6，其MK的产量达到25.56mg/L，远高于产量低的亲本菌株CICC10262。
　　(4)利用RT-PCR技术检测了MK生物合成相关基因menD、menB、menA在高产菌株BKU-6和原始菌株BS-53表达丰度的变化，分析了这些基因表达水平与MK产量提高的相关性。结果表明MK生物合成相关基因menD在高产菌株的整个发酵过程中始终保持高丰度表达，而原始菌株总体表达水平处于持续低迷状态，随着发酵时间的增加表达量有所增加，但变化不明显。因此menD基因的持续高表达与菌株的MK产量提高密切相关。MK生物合成基因menB在两个菌株的发酵过程中表达丰度变化与menD基因的表达变化类似，menB基因与MK的产量增加有一定的相关性，融合后菌株MK产量的提高与menB基因表达量呈正相对应。对于MK生物合成中的menA基因，高产菌株在不同时间段的表达量处于相对较低的水平，与原始菌株相比，表达量并没有显著增加的现象。因此，menA基因与MK产量提高没有直接联系，具体机制有待进一步探究。

目录

文摘

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致谢

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表格清单

第一章 绪 论

1.1 MK研究进展

1.1.1 MK的认知历史

1.1.2 MK的生理功能

1.2 原生质体融合技术概况

1.2.1 亲本菌株的遗传标记

1.2.2 原生质体制备与再生

1.2.3 电融合技术

1.3 课题的研究内容、目的和意义

1.3.1 研究内容

1.3.2 目的和意义

第二章 高产MK菌株的诱变和筛选

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 菌株

2.2.2 主要培养基

2.2.3 主要试剂

2.2.4 主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1 培养方法

2.3.2 紫外诱变

2.3.3 亚硝基弧诱变

2.3.4 诱变菌株的初筛和复筛

2.3.5 遗传稳定性试验

2.3.6 MK的提取和测定

2.3.7 突变菌株产MK液体发酵条件的优化

2.4 结果与讨论

2.4.1 BS-5菌的生长曲线

2.4.2 紫外诱变结果

2.4.3 NTG诱变结果

2.4.4 诱变后菌株MK产量的比较

2.4.5 菌株BS-53产MK能力遗传稳定性分析

2.4.6 BS-53产MK液体发酵成分的确定

2.5 本章小结

第三章 原生质体电融合选育MK高i产菌株

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 菌种

3.2.2 主要培养基

3.2.3 主要溶液

3.2.4 主要试剂

3.2.5 主要仪器

3.3 实验方法

3.3.1 亲株生长曲线的测定

3.3.2 原生质体制备

3.3.3 双亲本原生质体灭活

3.3.4 灭活原生质体电融合

3.3.5 融合子的检出及DNA含量的测定

3.3.6 融合子的复筛

3.3.7 融合子的遗传稳定性

3.4 结果与分析

3.4.1 菌株的生长曲线

3.4.2 青霉素预处理对亲株生长的影响

3.4.3 两亲本原生质体制备

3.4.4 亲本原生质体灭活条件的选择

3.4.5 亲本原生质体电融合条件的确定

3.4.6 融合子的检出及DNA含量的测定

3.4.7 融合子发酵性能试验

3.5 讨论

3.5.1 菌龄对原生质体制备的影响

3.5.2 青霉素预处理对原生质体制备的影响

3.5.3 灭活原生质体的讨论

3.5.4 电融合过程的讨论

3.6 本章小结

第四章 MK合成相关基因表达丰度的研究

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 实验菌株

4.2.2 主要试剂

4.2.3 主要仪器

4.2.4 主要培养基

4.2.5 培养方法

4.3 实验方法

4.3.1 总RNA的提取

4.3.2 反转录反应

4.3.3 PCR扩增

4.4 结果和分析

4.4.1 RNA浓度的测定与分析

4.4.2 menD基因的表达丰度分析

4.4.3 menB基因的表达丰度分析

4.4.4 menA基因表达丰度分析

4.5 本章小结

第五章 结论和展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文