蜡状芽孢杆菌β-CGTase发酵、基因克隆表达及其酶学性质研究

摘要

β-CGTase因为其广泛的应用价值，特别是在生产β-CD和药物分子修饰等方面有着巨大的前景。
　　论文首先筛选得到一株高产β-CGTase的菌株，然后对菌株进行了鉴定，确定为是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。以该蜡状芽孢杆菌BC-0801为出发菌株，利用10 keV，剂量为40×2.5×1013ions/cm2氮离子进行诱变选育，获得一株高产β-CGTase的菌株BC0802。然后对菌株的发酵条件进行优化，其最适培养基为：玉米粉3％，玉米浆1％，蛋白胨1％，酵母浸膏1.5％，K2HPO40.05％、MgSO4·7H2O0.01％；最适发酵pH为9.0，接种量为4％，发酵时间为36h，发酵温度为30℃。
　　在获取最佳产酶条件的基础上，从发酵液中提取粗酶液，再经过硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-150分离得到β-CGTase纯品。经SDS-PAGE测得酶的分子量为75kDa，Km=2.8153 g/L；酶的最适温度为60℃，最适pH为7.0，Ca2+对酶活有较大的促进作用，Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、CO2+、SDS对酶均有较强的抑制作用。
　　其次，通过分子生物学手段，对蜡状芽孢杆β-CGTase的基因进行了克隆，构建了温控型表达载体，转化大肠杆菌DH5α，最终实现了表达。工程菌的最佳诱导条件为：菌浓OD600为1.0，诱导时间为4h，起始培养基的培养温度为30℃，pH为8.0。诱导温度的分配为39℃，2h，41℃，1h，42℃，lh。从工程菌株体内提取粗酶液，再通过硫酸铵盐析、透析、Sephadex G-150凝胶分离得到较纯的β-CGTase。经SDS-PALGE测定该重组酶的分子量为85kDa，Km值为2.4508 g/L-1，最适温度为65℃，且该酶较耐高温，在90℃条件下，4h后酶活才会显著下降50％，在100℃下经过2h后酶活才会显著下降70％，最适pH为9.0。脲和Ca2+和Fe2+对酶活具有一定的促进作用，Mg2+、Zn2+、Tris、Co2+等对酶有很强的抑制作用。
　　将β-CGTase分别构建在以大肠杆菌DH5α为宿主的pET28质粒和以枯草芽孢杆菌为宿主的pAX01质粒上。且β-CGTase在这两株工程菌体内均实现了表达。
　　通过对蜡状芽孢杆菌产β-CGTase从菌株筛选、诱变到发酵条件优化，再到分子生物学研究，获得了一株高产β-CGTase的蜡状芽孢杆菌突变菌株和一株高产嗜热β-CGTase的工程菌株，建立了一个系统的研究方法，为将来的工业化生产奠定了一定的基础。

目录

文摘

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致谢

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表格清单

第一章 绪论

1.1 β-CD

1.2 β-CGTase

1.3 β-CGTase的研究进展

1.3.1 β-CGTase的性质和来源

1.3.2 β-CGTase的作用机理

1.33产β-CGTase菌株的筛选及诱变育种

1.3.4 β-CGTase基因的克隆与表达

1.3.5 β-CGTase的遗传修饰

1.3.6 β-CGTase的固定化的研究

1.4 本课题的研究意义

1.5 研究内容与思路

第二章 高产β-CGTase菌株的筛选、鉴定、诱变及发酵条件优化

2.1 引言

2.2 实验材料和仪器

2.2.1 实验材料

2.3 实验方法

2.3.1 菌株的筛选

2.3.2 酶活的测定方法

2.3.3 高产β-CGTasc菌株的鉴定

2.3.4 N+离子注入诱变

2.3.5 发酵条件的优化

2.4 结果与讨论

2.4.1 对土样的筛选结果及菌株的鉴定

2.4.2 N+注入诱变筛选高产β-CGTase突变菌株诱变剂量的确定

2.4.3 诱变、筛选的高产β-CGTase菌株及遗传稳定性

2.4.4 发酵条件的优化

2.5.本章总结

第三章 蜡状芽孢杆菌β-CGTase的纯化及酶学性质研究

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 实验菌株

3.2.2 主要仪器和试剂

3.3 实验方法

3.3.1 酶的分离纯化

3.3.2 酶学性质的研究

3.4 结果与讨论

3.4.1 β-CGTase的分离纯化

3.4.2 β-CGTase的酶学性质的研究

3.5.本章总结

第四章 β-CGTase的基因克隆、温控型质粒构建、表达及重组酶的性质研究

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验方法

4.3 结果和讨论

4.3.1 蜡状芽孢杆β-CGTase的克隆

4.3.2 工程菌E·coli-DH5α-pBV220-β-CGTase的构建

4.3.3 工程菌表达及表达条件条件优化

4.3.4 酶的分离纯化

4.3.5 E.coli-DH5α-pBV220-β-CGTase酶学性质的研究

4.4 本章总结

第五章 β-CGTase的IPTG诱导型表达载体的构建及其表达

5.1 引言

5.2 材料和方法

5.2.1 实验材料和试剂

5.2.2 实验方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 重组质粒pET28-β-CGTase的构建

5.4 本章小结

第六章 β-CGTase基因的IPTG诱导型表达载体的构建及其在枯草芽孢杆菌体内的表达

6.1 引言

6.2 材料和方法

6.2.1 实验材料和设备

6.2.2 实验方法

6.3 实验结果

6.3.1 pAX01-β-CGTase工程菌构建的质粒图谱示意图

6.3.2 β-CGTase基因扩增的结果

6.3.3 目的基因的回收

6.3.4 蓝白斑筛选结果

6.3.5 双酶切验证克隆结果

6.3.6 工程菌的预表达

6.4 本章小结

第七章 结论与展望

7.1 结论

7.2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文