载顺铂的壳聚糖温敏性水凝胶联合放疗对鼻咽癌的协同抗肿瘤作用研究

摘要

目的：为了研究载顺铂的壳聚糖温敏性水凝胶联合放疗对鼻咽癌的治疗作用，进一步探索其可能存在的抗肿瘤机制。　　方法:首先，我们将β-甘油磷酸钠（β-glycerophosphate，β-GP）、壳聚糖（Chitosan，CS）以及顺铂（cis-dichlorodiamineplatinum，DDP）按不同的比例制成了具有缓释特性的抗肿瘤药物制剂，即载顺铂的壳聚糖温敏性水凝胶（CS/DDP）。接下来，我们使用试管倒置法对CS/DDP的温度敏感性进行研究；通过流变仪研究CS/DDP的流变学特性；通过高效液相色谱仪（HPLC）测定CS/DDP的体外药物释放；噻唑蓝（MTT）试验测定空白壳聚糖水凝胶（Blank Chitosan Hydrogel，CS）与CS/DDP的体外细胞毒性；通过苏木精-伊红（H&E）染色法研究CS的组织相容性和生物可降解性。运用BALB/c小鼠建立5-8F鼻咽癌模型，将平均瘤体积约150mm3的70只裸鼠随机分为7组：(1)0.9%氯化钠注射液组(NS组)，(2)顺铂溶液组（5mg/kg）（DDP组），(3)载顺铂的壳聚糖水凝胶组（5mg/kg）（CS/DDP组），(4)单纯放疗组（RT组），（5）空白壳聚糖水凝胶+放疗组（CS+RT组），（6）顺铂溶液（5mg/kg）+放疗组（DDP+RT组），（7）载顺铂的壳聚糖水凝胶（5mg/kg）+放疗组（CS/DDP+RT组）。接着，腹腔或静脉注射120μl上述提及的药物，16小时后对需要进行放疗的组进行9Gy/3F放疗处理。治疗结束后第2天，分别在NS组、DDP组、CS/DDP组、RT组、CS/DDP+RT组、DDP+RT组、CS+RT组随机抽取3只裸鼠进行氟-18-脱氧葡萄糖正电子发射计算机断层显像（18F-FDG PET/CT）扫描，对经过上述治疗后鼻咽癌肿瘤组织的代谢情况进行评估。治疗结束后两天，每组随机处死2只裸鼠，留取裸鼠肿瘤标本行免疫组化检测并进一步评估γ-H2AX在该肿瘤组织中的表达情况。在治疗结束后第5天，从每个组随机抽取3只裸鼠并处死，将其心、肝、脾、肺、肾分别取下并送HE染色以对治疗的副反应进行评估；取其肿瘤行流式分析评估细胞周期表达及细胞凋亡，行免疫组化评估Ki-67及CD31表达情况，并对这种联合治疗方式可能存在的抗肿瘤机制进行初步探讨。从治疗第1天开始每两天对肿瘤的长短径进行1次测量，先对荷瘤小鼠的瘤体积进行记录和计算，记录结束后即可绘制肿瘤的生长曲线图。　　结果：1、载顺铂的壳聚糖凝胶与空白壳聚糖凝胶一样，都具有温度敏感性，并且与空白壳聚糖凝胶的温敏性是一致的。2、注射后1周切片可见壳聚糖水凝胶几乎原封不动地分布在肌肉组织中，在其周围分布有大量急慢性炎性细胞，但是在第6周没有发现明显的壳聚糖水凝胶样物质残留，其周边的炎性细胞也明显减少，这在一定程度上证实了壳聚糖水凝胶在机体中具有良好的生物降解能力和组织相容性。3、体外释放实验在一定程度上证实了顺铂能够较好地从载顺铂的壳聚糖水凝胶中释放出来，释放时间长达6天以上，证实其有较好的药物缓释特性。4、在MTT实验中，当顺铂浓度低于0.5ng/ml时，载顺铂的壳聚糖凝胶和顺铂水溶液二者的细胞毒性未表现出明显的统计学差异（P＞0.05），而当顺铂浓度大于0.5ng/ml时，载顺铂的壳聚糖凝胶对肿瘤细胞的抑制作用更强。5、与NS组（10.8天）、DDP组（12.6天）、CS/DDP组（13.4天）、RT组（18.4天）、CS+RT组（17.2天）、DDP+RT组（23天）相比，CS/DDP+RT组（31.4天）明显地抑制了肿瘤的生长（P＜0.01）。CS/DDP+RT组的中位生存期为81天，明显长于DDP+RT组（72天，p＜0.01）、CS+RT组（50天，p＜0.01）、RT组（51天，p＜0.01）、CS/DDP组（44天，p＜0.01）、DDP组（43天，p＜0.01）、NS组（42天，p＜0.01）。CS+RT组与RT组两个组对肿瘤生长的抑制作用及裸鼠的中位生存期未表现出明显的差异性（P＞0.05）。6、行18FDG-PET/CT检测裸鼠的肿瘤代谢情况，发现NS组的肿瘤代谢最强，即SUVmax最大，为1.9±0.22，明显高于CS/DDP+RT组（1.23±0.09）、DDP+RT组（1.47±0.05）、CS+RT组（1.57±0.09）、RT组（1.6±0.16）、CS/DDP组（1.7±0.08）、DDP组（1.83±0.18），且它们之间存在统计学差异（p＜0.05）。7、在行鼻咽癌瘤组织流式细胞学分析探索可能的抗肿瘤机制的实验中，发现CS/DDP+RT组G2/M期细胞占的百分比（72.61±1.17%）与DDP+RT组（65.13±1.47%），RT组（43.48±2.16%），CS+RT组（43.67±2.53%），CS/DDP组（35.51±1.77%），DDP组（33.94±1.71%）或NS组（29.03±1.82%）相比是最大的并且有统计学差异（p＜0.01）。CS/DDP+RT组的凋亡细胞占的百分比（76.23±1.13%）明显大于DDP+RT组（71.48±1.73%），RT组（38.70±1.51%），CS+RT组（37.72±1.34%），CS/DDP组（33.25±1.39%），DDP组（31.56±1.31%）)或NS组（14.23±1.42%），且它们之间存在具有统计学差异（p＜0.01）。8、Ki-67阳性表达数在CS/DDP+RT组（22.4±4.77%）最低，明显低于DDP+RT组(39.8±3.42%)，RT组(58.8±8.14%)，CS+RT组(57.2±6.622%)，CS/DDP组(75.3±4.12%)，DDP组(78.16±6.25%)或NS组(88.6±4.67%)，且它们之间存在统计学差异（p＜0.01）；CS/DDP+RT组的肿瘤组织中CD31阳性的微血管面积百分比（2.5±0.36%）明显低于DDP+RT组（4.2±0.29%），RT组（4.9±0.25%），CS+RT组（4.8±0.80%），CS/DDP组（9.2±0.88%），DDP组（9.3±0.54%）及NS组（10.4±0.36%），且它们之间存在统计学差异（P＜0.05）；此外，CS/DDP+RT组的γ-H2AX的阳性率为88.8±3.90%，明显高于DDP+RT组（69.1±4.26%），RT组（58.6±2.82%），CS+RT组（60.2±6.66%），CS/DDP组（43.4±5.03%），DDP组（45.6±3.79%）和NS组（4.5±0.51%），且它们之间存在统计学差异（P＜0.01）。9、每组均没有发现明显的毒副作用，包括饮食、活动及体重等情况。　　结论：1、载顺铂的壳聚糖凝胶与空白壳聚糖凝胶一样都具有较好的温度敏感性，并且与空白壳聚糖凝胶的温敏性是相同的。2、空白壳聚糖凝胶具有良好的生物降解性及组织相容性，具有较好的药物缓慢释放作用，且与游离的顺铂相比，载顺铂的壳聚糖凝胶具有较低的细胞毒性，说明壳聚糖水凝胶是一种安全的药物传递系统。3、与RT组、DDP+RT组、CS+RT组、CS/DDP组、DDP组及NS组相比，CS/DDP+RT组明显降低了荷瘤裸鼠肿瘤的代谢，从而抑制了肿瘤的生长，且延长了裸鼠的中位生存期。其抗肿瘤作用的优势可能主要源于CS/DDP+RT增加了肿瘤细胞γ-H2AX的表达，使肿瘤细胞停滞于G2/M期，加速肿瘤细胞凋亡。此外，CS/DDP+RT也降低了肿瘤细胞Ki-67的表达及肿瘤的微血管密度，这也是其抗肿瘤作用较强的原因之一。

目录

前言

材料与方法

1 实验材料和仪器

1.1 实验动物

1.2 细胞株

1.3 主要试剂

1.4 主要实验仪器

2 实验方法

2.1 载顺铂的壳聚糖水凝胶的制备

2.2 载顺铂的壳聚糖水凝胶的温度敏感性

2.3 载顺铂的壳聚糖水凝胶的体外药物释放研究

2.4 载顺铂的壳聚糖水凝胶的细胞毒性评估

2.5 载顺铂的壳聚糖水凝胶的组织相容性及生物可降解性评价

2.6 5-8F鼻咽癌皮下动物实验模型的建立及治疗

2.7 血流动力学实验

2.8 流式细胞学分析

2.9 免疫组化检测Ki-67、CD31及γ-H2AX的表达

2.10 治疗后荷瘤裸鼠的情况

2.11 统计学分析

结果

1 载顺铂的壳聚糖水凝胶的制备及流变学特性

2 载顺铂的壳聚糖水凝胶的体外药物释放及细胞毒性试验

3 载顺铂的壳聚糖水凝胶的组织相容性及生物可降解性

4 血流动力学试验

5 载顺铂的壳聚糖水凝胶联合放疗对鼻咽癌的抗肿瘤作用

6 流式细胞学分析

7 免疫组织化学分析

8 荷瘤鼠的一般情况

讨论

结论

参考文献

英文缩略词表

致谢

在校期间发表的论文

综述:鼻咽癌放疗相关药物的研究进展

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