转运蛋白配体Ro5-4864对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中炎症反应的影响

摘要

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH），是常见的出血性脑卒中，具有较高的致死率和致残率，极大地威胁着人类的健康。虽随着外科干预治疗手段的不断进步，SAH的预后有所改善，但目前仍缺乏有效的治疗干预措施。SAH可引起原发性损伤和炎症、水肿等继发性损伤。近年有学者提出，SAH后72h内所引发的早期脑损伤（early brain injury,EBI）影响着SAH的预后与转归，而该观点已在临床及基础研究中被证实，其中炎症反应可能是造成神经元受损的重要因素。SAH后可迅速发生炎症反应，主要涉及小胶质细胞和星形胶质细胞激活、外周炎性细胞浸润，并伴随大量炎症因子产生。由于涉及的神经细胞及细胞因子彼此相互调节，又有各自发挥着的作用，因此研究SAH后神经炎症有助于了解SAH后疾病的发展和指导治疗方案的制定。在既往的研究发现，转运蛋白(translocator protein,TSPO)可以调控炎症细胞的激活，进而影响炎症反应进程。　　TSPO为既往外周苯二氮卓受体中的一个亚单位结构，广泛分布于机体组织中。TSPO的亚细胞结构主要位于线粒体外膜上，少部分位于核周和细胞表面，在细胞的多种生理过程中发挥着重要作用。既往发现，当脑组织暴露于一系列病理环境时，TSPO表达量将会明显上调，而这种现象已在多种疾病模型中证实。因此，大量学者将TSPO作为中枢神经系统疾病中炎症反应的标志物，并通过分子影像学技术对其进行研究。同时TSPO及其配体在神经系统疾病的治疗中显示出了极大的潜能，然而目前SAH后TSPO表达及配体的相关研究却非常缺乏。此外，TSPO参与了多种生理过程，其中最为重要的是胆固醇物质的转运，作为该过程的限速步骤，可显著调节神经类固醇的合成。既往研究证实，TSPO与特异性配体结合后，能够促进神经类固醇生成、缓解神经性疼痛和减轻神经炎症反应，因此被认为是一种潜在的治疗靶点。Ro5-4864（7-chloro-5-4-Chlorophenyl-1,3-dihydro-1-methyl-2-H-1,4-benzod-iazepin-2）是苯二氮卓类药物的衍生物，已在多种神经毒性病理实验中证实可通过调节神经类固醇激素的合成，进而发挥神经保护作用，但目前对于SAH后Ro5-4864是否能影响炎症反应及可能的机制尚未见相关报道。　　本研究通过建立了小鼠实验性SAH动物模型，第一部分将探索TSPO在SAH后的表达情况，第二部分将初步研究TSPO的配体Ro5-4864对SAH后炎症反应的影响，为临床治疗SAH提供实验依据。　　一、TSPO在SAH后早期表达情况的初步研究　　目的：评估SAH后早期脑组织中TSPO的表达情况及其与EBI的关系。　　方法：将44只C57BL/6J小鼠随机分成Sham组和SAH组，通过血管内穿刺法构建SAH模型，采用改良加西亚评分对小鼠进行神经功能评定，以western blot技术检测SAH后脑组织TSPO表达情况，结合正电子发射计算机断层显像(positron emission tomography-computed tomography，PET-CT)和免疫荧光评价TSPO空间表达情况。　　结果：SAH组小鼠神经功能评分明显低于Sham组；western blot提示脑组织中TSPO从6h开始逐渐升高，并在48h达到峰值，差异具有统计学差异(P＜0.05)，72h仍高于Sham组。PET-CT提示SAH后小鼠脑组织示踪剂摄取量较Sham组升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。免疫荧光提示出血侧顶叶皮层、海马区和基底皮层均有TSPO表达增加。相关性分析提示神经功能评分与TSPO表达水平呈负相关(r=-0.6156，P＜0.01)。　　结论：TSPO在SAH后表达广泛增加，并呈现时间依赖性，可能与早期脑损伤的发生发展相关。　　二、Ro5-4864对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中炎症反应的影响　　目的：通过构建小鼠蛛网膜下腔出血模型，观察小鼠神经功能缺损情况，初步探讨Ro5-4864对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中炎症反应的影响。　　方法：将27只C57BL/6J小鼠随机分成假手术组（Sham组）、蛛网膜下腔出血组（SAH+DMSO组）和蛛网膜下腔出血药物治疗组（SAH+Ro5-4864组）。SAH+Ro5-4864组在建立模型后30min完成首次给药，通过腹腔注射Ro5-4864（5mg/kg，1%DMSO生理盐水），建模后24h再次给药，Sham组和SAH+DMSO组给予等体积1%DMSO生理盐水作为对照。记录建立模型前后各组小鼠体重及神经功能评分；干湿重法测量脑组织含水量情况；实时荧光定量PCR和ELISA测定TNF-α、IL-1β的表达情况。　　结果：SAH可导致小鼠体重减轻，引起神经炎症反应及运动神经功能障碍。Ro5-4864缓解了SAH后小鼠体重的丢失，减少了脑组织含水量和降低了TNF-α的表达，一定程度地促进了神经功能恢复，但不能减少IL-1β的表达。　　结论：TSPO配体Ro5-4864具有一定的神经保护功能，可缓解小鼠SAH后体重下降和脑组织炎症因子升高水平，并改善小鼠神经功能缺损，为临床对SAH后的综合治疗提供实验依据。

目录

前言

蛛网膜下腔出血后转运蛋白表达情况研究

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要实验试剂

3 实验方法

结果

1 模型建立情况

2 18F-FEPPA合成情况

3 小鼠建模后神经功能评分情况

4 TSPO在SAH后的表达情况

5 PET-CT评估SAH后脑组织中TSPO表达情况

6 TSPO在脑组织不同部位的分布情况

7 神经功能评分与TSPO表达量相关性

讨论

小结

Ro5-4864对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中神经炎症的影响

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要实验试剂

3 实验方法

结果

1 模型建立

2 小鼠体重改变情况

3 小鼠神经功能评分情况

4 脑组织含水量情况

5 实时荧光定量PCR测量脑组织炎症因子基因表达情况

6 ELISA检测脑组织中炎症因子表达情况

讨论

小结

参考文献

全文总结

英汉缩略词对照表

致谢

综述:转运蛋白及配体Ro5-4864在神经系统疾病中的研究与进展

参考文献

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