基于极光激酶A介导的p73信号途径研究华蟾毒配基对p53突变型肝癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响

摘要

背景：　　极光激酶（AURKA）是一种参与调节有丝分裂和减数分裂所必需的激酶，也是参与调控细胞周期的重要分子，和细胞扩增与繁殖有直接联系。AURKA基因的扩增和异常表达与肝癌的发生发展及耐药密切相关。野生型p53是一个有着丰富功能的抑癌基因，它可以从调控细胞周期、诱导凋亡等多个方面起到抗肿瘤的作用，但是p53发生突变后抑癌功能丧失，其在肝癌的上皮间质转化和转移中发挥作用，促进肿瘤的发生。p53作为AURKA多个作用底物之一，它们之间也有着紧密的联系。p73作为p53的同源基因，因为在结构功能上与p53高度相似，而且在小鼠的基因研究中已经被证实其可以作为肿瘤抑制因子，所以也被视为人类潜在的抗肿瘤靶点之一。前期研究已经证实中药蟾酥活性成分华蟾毒配基能够下调AURKA水平，加重肝癌HepG2细胞的G2/M期阻滞并抑制其增殖。　　目的：　　本研究是为了进一步研究华蟾毒配基对p53突变的肝癌Huh7细胞是否有同样的抑制作用，并探讨AURKA在华蟾毒配基抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡及调节p53和p73途径中扮演的角色。　　方法：　　1.对Huh7细胞进行AURKA转染和药理学抑制剂处理：从Huh7细胞获得全长AURKA cDNA与引物进行PCR，将PCR产物克隆到pCDNA3.1-3×Flag的质粒中，构建表达载体的pCDNA3.1×3Flag-AURKA质粒。然后用转染试剂将AURKA转染入Huh7细胞中，接着用G418筛选出稳定的 Huh7/AURKA 细胞系。用AURKA 抑制剂PF-03814735处理肝癌Huh7细胞。用华蟾毒配基分别作用Huh7细胞、Huh7/AURKA细胞和PF-03814735处理的Huh7细胞。　　2.运用MTT法、流式细胞术、Hoechest33342荧光染色法和Western blot法检测华蟾毒配基对不同状态的Huh7细胞的细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和相关分子表达的影响并进行统计分析。　　3.统计学方法：实验数据均以(x)±s 表示。用 SPSS22.0 软件进行统计分析，两两比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析和Dunnett t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。　　结果：　　1.MTT法、流式细胞术和Hoechest33342荧光染色的检测结果显示，华蟾毒配基有显著抑制Huh7细胞增殖、诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期的作用（P＜0.01），过表达AURKA或AURKA抑制剂显著削弱或增强了华蟾毒配基抑制Huh7细胞增殖、诱导凋亡和阻滞细胞周期的作用（P＜0.01）。　　2.Westernblot检测显示，华蟾毒配基能下调周期相关蛋白Cyclin B1、CDK1、CDK2和PCNA表达（P＜0.01），上调凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2 比例(P＜0.01），能下调AURKA和突变型p-P53以及p-MDM2、p-hnRNPK的表达（P＜0.01），上调p73、p-P73及其下游靶基因p21、Puma和Noxa蛋白表达(P＜0.01）。过表达AURKA或AURKA抑制剂显著削弱或增强了华蟾毒配基对上述分子表达的调节。　　结论：　　华蟾毒配基具有抑制Huh7细胞增殖、阻滞细胞周期和诱导凋亡的作用，可能通过抑制AURKA和突变型p53，并上调p73信号途径，发挥其抑制Huh7细胞增殖和诱导凋亡的作用。

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