磷脂酶A1的发酵制备、分离纯化及催化特性的研究

摘要

酶法脱胶是油脂精炼过程中的一种生化脱胶技术，相比传统脱胶方法，具有高效、绿色环保等优点。目前市场上使用的磷脂酶存在反应条件要求严格，不能回收利用等问题，限制了磷脂酶在工业生产中的应用。 本研究以实验室保存的Bacillus cereus sp.AF-1为出发菌株，以提高发酵液磷脂酶活力为目的，优化发酵工艺得到较高酶活力的粗酶液，通过分离纯化得到磷脂酶并对其性质进行分析评价;采用化学修饰、固定化等方法来提高磷脂酶的稳定性和重复使用性，以期为磷脂酶的开发利用探索新的途径。主要研究内容与结果如下: 1.采用NaOH滴定法测定磷脂酶活力，通过单因素实验和响应面实验优化，确定磷脂酶活力测定的最优条件为:底物质量浓度4 g/100mL、反应终点pH值9.0、酶液稀释倍数100倍、反应pH值5.1、反应温度53℃、反应时间8 min。结果表明NaOH滴定法是一种准确、快捷的测定磷脂酶活力的方法。 2.以Bacillus cereus sp.AF-1为出发菌株，采用发酵法得到粗酶液，通过对培养基组成和发酵工艺条件的优化，并从摇瓶水平扩大到15L发酵罐水平，得到的最佳培养基为:葡萄糖浓度为2％，蛋白胨浓度为3％，无机盐的组成为:Na2HPO4·12H2O1.5％, KH2PO4·2H2O0.3％，MgSO4·7H2O0.06％，CaCl20.01％;15L发酵罐最佳发酵条件为:发酵时间为30 h、发酵温度为35℃、发酵液pH为7.5、接种量为10％、通气量为0.3 m3/h。此条件下得到的粗酶液酶活力为41.57 U/mL。 3.粗酶液通过硫酸铵沉淀及透析、DEAE-52离子交换层析、葡聚糖凝胶G-75凝胶层析等方法进行分离纯化，得到的磷脂酶类型为PLA1，其分子量为20 kD，酶活力为1195.24U/mg，磷脂酶A1的Km和Vmax分别为11.11 mg/mL和1.302 mmol/L·mg;最佳作用温度和pH值分别为35℃和7.5;4℃下贮藏5周，磷脂酶的酶活力没有变化，贮藏8周，能保持90％以上的酶活力。 4.采用化学修饰剂CC-mPEG对磷脂酶进行修饰，当修饰率为14％，酶活力回收率为88.75％时，得到的修饰酶MPLA1分子量约为25 kD，MPLA1的热稳定性、pH稳定性、对底物的亲和力以及催化效率都得到了提高。酶在337nm处最大荧光强度的降低和圆二色谱β-折叠的降低和回转的升高，从MPLA1结构上进一步说明了修饰酶比PLA1具有更好的稳定性。 5.采用聚乙烯醇-海藻酸钠为载体，以固定化酶的活力，酶活力回收率和稳定性等参数为主要评价指标，对磷脂酶进行固定化，确定最佳工艺条件为:载体聚乙烯醇和海藻酸钠的浓度分别为10％和2％，交联剂硼酸和氯化钙的浓度分别为4％和2％，固定化时间为30 min，酶的添加量为10 mg/100g，固定化酶(IPLA1)的粒径为4mm;相比游离酶，IPLA1的最佳作用温度和pH值以及热稳定性和pH稳定性较游离酶得到提高;IPLA1重复使用8次，剩余酶活力仍然超过50％;在4℃下贮藏9周，IPLA1能保持90％以上的酶活力。 6.粗酶、纯化后的磷脂酶(PLA1)、修饰酶(MPLA1)和固定化酶(IPLA1)用于菜籽毛油脱胶，以毛油中磷含量为依据，对四种酶的脱胶效果进行比较，研究结果表明:粗酶能将毛油中磷含量降低到10 mg/kg以下，但酶的使用量和作用时间均高于其他三种酶;当添加量为480 U/kg，处理3h时，PLA1和IPLA1将毛油中磷的含量降低到10 mg/kg以下，MPLA1将毛油中磷的含量降低到5 mg/kg以下。PLA1经化学修饰和固定化后得到的MPLA1和IPLA1具有较好的脱胶效果。

目录

声明

摘要

致谢

缩写词对照表

第一章 绪论

1．1 磷脂酶概况

1．1．1 磷脂酶的类型

1．1．2 磷脂酶类型的确定方法

1．1．3 微生物发酵产磷脂酶A1的特性研究

1．1．4 磷脂酶A1活力的检测方法

1．2 磷脂酶改性

1．2．1 酶的化学修饰

1．2．2 酶的遗传修饰

1．3 磷脂酶固定化

1．3．1 固定化方法

1．3．2 固定化载体

1．4 磷脂酶脱胶概况

1．4．1 磷脂酶脱胶作用机理

1．4．2 磷脂酶脱胶应用研究

1．5 研究背景及研究内容

1．5．1 研究背景

1．5．2 研究内容

参考文献

第二章 PLA1活力快速测定方法

引言

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料及试剂

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 实验方法

2．1．4 数据处理与分析

2．2 结果与讨论

2．2．1 底物质量浓度对磷脂酶活力的影响

2．2．2 反应终点pH值对磷脂酶活力的影响

3．2．3 酶液稀释倍数对磷脂酶活力的影响

3．2．4 反应时间对磷脂酶活力的影响

3．2．5 反应温度对磷脂酶活力的影响

3．2．6 反应pH对磷脂酶活力的影响

3．2．7 酸碱滴定法测定磷脂酶活力条件的优化

2．3 本章小结

参考文献

第三章 发酵产磷脂酶过程分析及工艺研究

引言

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料与试剂

3．1．2 主要仪器

3．1．3 实验方法

3．1．4 分析方法

3．1．5 数据处理与分析

3．2 结果与讨论

3．2．1 种子液的优化

3．2．2 发酵培养基的优化

3．2．3 发酵条件的优化

3．2．4 粗酶液中磷脂酶的最佳作用温度和pH

3．2．5 发酵罐(15 L)扩大培养条件优化

3．3 本章小结

参考文献

第四章 磷脂酶的分离纯化及酶学性质研究

引言

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料与试剂

4．1．2 主要仪器设备

4．1．3 实验方法

4．1．4 分析方法

4．1．5 数据处理与分析

4．2 结果与讨论

4．2．1 硫酸铵分级沉淀

4．2．2 DEAE-52阴离子交换层析

4．2．3 Sephadex G-75凝胶过滤层析

4．2．4 纯化结果及SDS-PAGE电泳鉴定

4．2．5 磷脂酶类型的确定

4．2．6 磷脂酶的反应动力学常数测定

4．2．7 磷脂酶的最佳作用温度和pH及其耐受性

4．2．8 磷脂酶的贮藏稳定性

4．3 本章小结

参考文献

第五章 磷脂酶A1的CC-mPEG修饰研究

引言

5．1 材料与方法

5．1．1 实验材料与试剂

5．1．2 主要仪器设备

5．1．3 实验方法

5．1．4 分析检测方法

5．1．5 数据处理与分析

5．2 结果与讨论

5．2．1 氨基酸自动分析仪测定赖氨酸含量

5．2．2 不同摩尔比对磷脂酶修饰影响

5．2．3 不同修饰率磷脂酶的最佳作用温度及耐热性

5．2．4 不同修饰率磷脂酶的最佳pH及pH稳定性

5．2．5 磷脂酶催化动力学常数

5．2．6 磷脂酶修饰前后分子量变化

5．2．7 红外光谱分析

5．2．8 荧光光谱分析

5．2．9 圆二色谱分析

5．2．10 贮藏稳定性

5．3 本章小结

参考文献

第六章 磷脂酶A1的固定化研究

引言

6．1 材料与方法

6．1．1 实验材料与试剂

6．1．2 主要仪器设备

6．1．3 实验方法

6．1．4 分析方法

6．1．5 数据处理与分析

6．2 结果与讨论

6．2．1 固定化时间对IPLA1酶活力和酶活力回收率的影响

6．2．2 交联剂对IPLA1酶活力和酶活力回收率的影响

6．2．3 固定化载体对IPLA1酶活力和酶活力回收率的影响

6．2．4 酶的浓度对IPLA1酶活力和酶活力回收率的影响

6．2．5 固定化酶粒径对IPLA1酶活力和酶活力回收率的影响

6．2．6 固定化磷脂酶最适作用条件

6．2．7 磷脂酶固定化前后热稳定性和pH值稳定性

6．2．8 固定化磷脂酶操作稳定性

6．2．9 固定化磷脂酶贮藏稳定性

6．2．10 酶促反应动力学常数

6．2．11 红外光谱分析

6．2．12 固定化磷脂酶的形态

6．3 本章小结

参考文献

第七章 菜籽毛油的磷脂酶脱胶研究

引言

7．1 材料与方法

7．1．1 实验材料及主要试剂

7．1．2 主要仪器设备

7．1．3 实验方法

7．1．4 分析方法

7．1．5 数据处理与分析

7．2 结果与讨论

7．2．1 粗酶用于菜籽毛油脱胶效果的影响

7．2．2 PLA1用于菜籽毛油脱胶效果的影响

7．2．3 MPLA1用于菜籽毛油脱胶效果的影响

7．2．4 固定化酶用于菜籽毛油脱胶效果的影响

7．3 本章小结

参考文献

第八章 结论与展望

8．1 结论

8．2 创新点

8．3 展望

攻读博士学位期间发表论文情况