添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法的建立及应用

摘要

沙门氏菌是人类食源性疾病的重要病原细菌,也是引起食物中毒最为常见的病原菌之一。在全球范围内,因沙门氏菌引发的食物中毒事件发生频繁,且影响范围广,造成巨大的安全隐患。因此提高沙门氏菌检测技术显更为重要,尤其是快速简便的检测技术。目前,PCR检测技术以其检测操作方法简单、检测周期短、特异性好等特点,已广泛应用于在食品中沙门氏菌的检测。但近来一些应用实践表明,PCR检测方法存在一些不足,其检测结果会存在假阴性现象,造成漏检。因此,可以有效的减少或消除PCR检测可能存在的假阴性问题,成为近来研究的热点。
　　本课题针对沙门氏菌PCR检测易出现假阴性现象,利用复合引物法构建扩增内标,建立添加内标的沙门氏菌 PCR检测方法,并对人工污染蛋液、105份样品进行检测来验证其应用于食品样品检测的效果。主要结论如下:
　　1)针对沙门氏菌invA基因,成功设计并经PCR反应验证的一对沙门氏菌特异性PCR检测引物,建立并优化PCR反应体系。
　　2)利用复合引物法成功构建长度为484 bp的扩增内标片段,并确定PCR体系内标最适添加浓度为2.66×102拷贝/PCR,且添加后不影响PCR的检测灵敏度。
　　3)PCR检测体系经验证特异性、重现性良好,灵敏度可达6.35 fg/μL;人工染菌实验表明,起始染菌量为3.2 cfu/25 mL时,仅需8小时增菌培养便可检出,相对国标法,大大降低了检测时间;105份食品样品检测证明,该检测体系确实可以有效的避免PCR检测过程出现的假阴性,提高检测准确性。

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第一章 绪论

1.1沙门氏菌研究现状

1.2沙门氏菌的检测技术

1.3扩增内标的研究现状

1.4 课题来源

1.5 课题研究主要内容及意义

第二章 建立并优化沙门氏菌PCR检测方法

2.1 实验材料与设备

2.2 实验方法

2.3 结果及分析

2.4 本章小结

第三章 扩增内标的构建

3.1 实验材料及设备

3.2 实验方法

3.3 结果及分析

3.4 本章小结

第四章 沙门氏菌PCR检测方法的特性考察及应用

4.1实验材料及设备

4.2实验方法

4.3 结果及分析

4.4 本章小结

第五章 结论及展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文