基于ERS通路比较研究苦参素对不同分化程度人胃癌细胞的体外抑制作用

摘要

研究背景：　　胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，其治疗难度高，预后效果差，死亡率高，严重威胁人类身体健康。据中国2015年癌症统计数据指出，中国胃癌发病总数为67.9万左右，其排名仅次于肺癌(73.3万)，胃癌的死亡总例数为49.8万左右，同样仅仅低于肺癌，在肿瘤死亡率排行中位居第2位，因此，胃癌防治仍是中国医疗卫生领域亟待解决的难题。目前临床上对胃癌患者常常采取以手术为主的综合治疗，然而对于中晚期病人来说效果欠佳，1年转移率为38%，5年转移率为76%。近年来中医药治疗胃癌备受关注，中药不仅能够减轻各型胃癌的临床症状，而且可以有效地缓解化疗的毒副作用，改善治疗效果，延长患者的生存时间。　　苦参素又叫氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT)，是从中草药苦参中提取的有效成分。中医认为苦参味苦、性寒，入胃经，具有清热解毒、杀虫之效果，人们常用来根治湿疹、痢疾、喉痛及咳嗽等疾病。西医则认为苦参素（氧化苦参碱）具有抗过敏、抗炎、抗病毒、抗纤维化、保护心血管和升高白细胞的药物作用，近年来研究发现，苦参素能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，其中包括多种胃癌细胞系，但是，关于苦参素对不同分化程度人胃癌细胞体外抑制作用差异的研究鲜有报道。　　胃癌的发生发展是一个渐进的过程，从最开始的人正常胃粘膜上皮细胞到最终的胃癌细胞经历了多个步骤。研究人员最初通过对临床切取的不同分化程度的人胃癌组织（包括高分化、中分化、低分化肿瘤组织），使用专业技术手段使其永生化，从而获得不同分化水平的人胃癌细胞系。人工培育的不同分化程度胃癌细胞系，不仅从形态上和生长速度上保持了人胃癌细胞分化程度的差异性，同时从微观方面显示了胃癌基因突变表达程度的差异。近年来专家学者（包括导师本人）对苦参素的抗肿瘤作用做了大量的研究，但是苦参素对不同分化程度人胃癌细胞抑制作用的差异鲜见报道，所以比较苦参素对低、中、高分化程度人胃癌细胞的抑制作用及其内质网应激通路上相关指标作用的差异，不仅能够进一步验证苦参素对三种不同分化程度人胃癌细胞具有体外抑制作用，也可以探究不同分化程度人胃癌细胞系对苦参素药物浓度反应是否具有差异或差异如何，以期为苦参素应用于临床上不同恶性程度胃癌的个体化治疗提供实验依据。　　目的：　　本研究通过体外实验比较研究苦参素对不同分化程度人胃癌细胞（人高分化胃癌MKN28细胞、人中分化胃癌SGC7901细胞、人低分化胃癌MGC803细胞）的抑制作用，探讨苦参素对不同分化程度人胃癌细胞体外抑制作用的差异性，并基于内质网应激途径阐明苦参素诱导不同分化程度人胃癌细胞凋亡的分子生物学差异，旨在为临床上苦参素个体化治疗胃癌提供一定的实验依据。　　方法：　　1.将不同分化水平的人胃癌细胞进行传代培养，使用生长状态良好的细胞开展实验。各组细胞分成6组：阳性对照组（0.5mg/ml氟尿嘧啶）、阴性对照组（等体积的细胞培养液，不使用苦参素）、2mg/ml苦参素药物组、4mg/ml苦参素药物组、6mg/ml苦参素药物组、8mg/ml苦参素药物组，使用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测苦参素干预12h、24h、36h、48h后各个细胞系细胞生长活性，并计算其生长抑制率，然后运用SPSS17.0计算出各个细胞各个时间点的半数抑制浓度IC50，筛选后续实验浓度；　　2.Annexin-V FITC/PI双染后，运用共聚焦显微镜技术，观察苦参素作用于不同分化程度人胃癌细胞24h、48h后的细胞凋亡形态；　　3.采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测苦参素对不同分化程度人胃癌细胞24h、48h后细胞凋亡及细胞周期的影响；　　4.实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测苦参素诱导各组细胞24h、48h后相关mRNA（Caspase-3、Caspase-4、GRP-78、CHOP mRNA）相对表达水平的差异；　　5.免疫印迹法（Western Blot,WB）检测苦参素对不同分化程度人胃癌细胞作用24h、48h后凋亡相关蛋白（Caspase-3、Caspase-4、GRP-78、CHOP）相对表达量的差异。　　结果：　　1．MTT实验结果　　⑴苦参素对三种不同分化程度人胃癌细胞均具有体外抑制作用，与阴性对照组相比，结果均具有统计学意义（P<0.05），并且三种细胞的生长抑制率均随时间的延长，剂量的增加而增大；　　⑵从总体上看，细胞分化程度不同，苦参素干预后，抑制作用也不同，细胞分化程度越低，苦参素抑制作用越强；　　⑶运用SPSS17.0计算出各个细胞各个时间点的半数抑制浓度IC50，其中实验2最终选择分化程度相对居中的SGC7901细胞苦参素干预48h后的IC50浓度作为实验浓度。　　2．共聚焦显微镜观察各组细胞的凋亡形态　　共聚焦显微镜下MKN28、SGC7901、MGC803分别呈现明显的凋亡形态，主要表现在细胞核红染，细胞膜绿染，细胞体积固缩趋于圆形，胞浆不均匀，细胞核边缘化或者碎裂，呈颗粒状。　　3．FCM检测苦参素对各组细胞凋亡及细胞周期的影响　　3.1 细胞凋亡　　同一浓度的苦参素分别作用于不同分化程度人胃癌细胞24h、48h后，SGC7901细胞组、MGC803细胞组细胞凋亡率均高于MKN28细胞组，与MKN28细胞组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　3.2 细胞周期　　苦参素作用后，人高分化胃癌MKN28细胞组、人中分化胃癌SGC7901细胞组、人低分化胃癌MGC803细胞组细胞周期时象均呈现G0/G1期细胞所占比例高于S期和G2/M期。　　4．RT-qPCR结果　　结果显示，Caspase-3、Caspase-4、CHOP mRNA相对表达水平随着分化程度的降低而上调，GRP-78mRNA相对表达量随着分化程度的降低而下降，且与高分化MKN28细胞组比较，其差异均具有统计学意义（P＜0.05）。　　5．WB结果　　实验结果表明，与MKN28细胞组比较，GRP-78蛋白随着分化程度的降低而下降，而Caspase-3、Caspase-4、CHOP蛋白的相对表达水平随着分化程度的降低而上升，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　结论：　　1.苦参素对MKN28、SGC7901、MGC803细胞均具有明显的生长抑制作用，且其抑制作用具有时间剂量依赖关系；　　2.苦参素对MKN28、SGC7901、MGC803细胞体外抑制作用不同；　　3.苦参素对MKN28、SGC7901、MGC803细胞诱导凋亡作用不同，苦参素对MGC803细胞诱导凋亡作用最强，且苦参素可能是将胃癌细胞阻滞在G0/G1期而诱导其凋亡的；　　4.苦参素能够诱导MKN28、SGC7901、MGC803细胞凋亡，并且其相关分子生物学机制不同。

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摘要

Abstract

缩略语表

前言

实验1 苦参素对不同分化程度人胃癌细胞的体外抑制作用研究及浓度筛选

材料与方法

1材料与仪器

1.1细胞株

1.2试剂与耗材

1.3实验仪器设备

1.4试剂配制

1.4.1 MTT的配制

1.4.2完全培养基的配制

1.4.3冻存液的配制

2方法与步骤

2.1.2细胞换液

2.1.3细胞形态观察

2.1.4细胞传代

2.1.5细胞冻存

2.1.6细胞计数

2.2实验分组

2.3.2 MTT实验步骤

3统计学处理

结果

1细胞形态学观察

1.1 MKN28细胞形态

1.2 SGC7901细胞形态

1.3 MGC803细胞形态

2 MTT实验结果

2.1苦参素对三种不同分化程度人胃癌细胞的体外抑制作用

2.2比较苦参素对三种不同分化程度人胃癌细胞的体外抑制作用

2.3 IC50结果

实验2 基于ERS通路同一浓度下比较研究苦参素对不同分化程度人胃癌细胞的体外抑制作用

材料与方法

1材料与仪器

1.1细胞株

1.2试剂与耗材

1.3实验仪器设备

1.4试剂配制

1.4.1 10% SDS的配制

1.4.2 10% AP的配制

1.4.3 1.5mol/L Tris·HCl（pH=8.8）的配制

1.4.4 0.5mol/LTris·HCl (pH=6.8)的配制

1.4.5 1mol/LTris·HCl (pH=7.5)的配制

1.4.6 30%Acr/Bic (30%T，2.67%C)的配制

1.4.7 分离胶和浓缩胶的配制

1.4.8 10×电泳缓冲液的配制

1.4.9 10×转膜缓冲液的配制

1.4.10 10×TBS缓冲液的配制

1.4.11 TBS-T缓冲液的配制

1.4.12 封闭液（5%脱脂奶粉TBST溶液）的配制

1.4.13 抗体稀释液的配制

2方法与步骤

具体培养方法同实验1。

2.2实验分组

2.3.1操作步骤

2.4 FCM测定细胞凋亡及细胞周期差异

2.4.1 FCM实验原理

2.4.2操作步骤

2.5.2 实验操作步骤

2.6 WB法检测各组凋亡相关蛋白的表达差异

2.6.1 WB法实验原理

2.6.2 WB操作步骤

3 统计学处理

结果

1共聚焦显微镜观察细胞凋亡形态

2 FCM检测苦参素对各组细胞凋亡和细胞周期的影响

2.1比较细胞凋亡的差异

注：与MKN28细胞组比较，*P＜0.05，** P＜0.01，下图、下表同。

2.2细胞周期结果

3 RT-qPCR比较凋亡相关基因的表达差异

4 WB法检测凋亡相关蛋白的表达差异

讨论

1医学对胃癌的认识

2 FCM检测苦参素对不同分化程度人胃癌细胞凋亡和生长周期的影响

3基于ERS通路探讨苦参素诱导各组细胞凋亡的分子生物学机制的差异

4展望

结论

致谢

参考文献

附录

附录1 附图

附录2 综述

附录3 在校期间论文论著和科研情况