智能抗肿瘤药物递送系统的设计及体外评估

摘要

近年来，基于肿瘤微环境与正常组织微环境之间的差异来设计抗肿瘤药物递送系统，在肿瘤治疗过程中占据着越来越重要的地位。由于纳米抗肿瘤药物递送系统能改善目前所用化疗药物的安全性及提高治疗效果，因此纳米抗肿瘤药物递送系统的研究和应用引起了广泛的关注。此外，为了进一步增强治疗效果，这些纳米抗肿瘤药物递送系统被设计为基于内部刺激的纳米药物递送系统，即pH敏感药物递送系统，还原敏感纳米药物递送系统，及基于外部刺激的纳米药物递送系统，例如光辐射纳米药物递送系统。基于此，为了改善化疗药物的安全性及提高治疗效果，本论文基于不同的材料（譬如天然聚电解质、可控合成的嵌段共聚物及氧化石墨烯）构建具有不同结构的抗肿瘤药物递送系统，而且不同的相互作用（譬如静电相互作用、疏水相互作用及π-π相互作用）被用来有效地负载抗肿瘤药物阿霉素。此外，这些抗肿瘤药物递送系统具有如pH、还原及光响应特性，而且集靶向性、低细胞毒性、可降解性及分子成像特性与一身。本论文主要包括以下几个部分。　　首先，我们通过层层自组装方法将FITC功能化壳聚糖及透明质酸钠（分别作为聚阳离子及聚阴离子）包覆在磺化聚苯乙烯微球模板上，最后一层控制为乳糖酸功能化壳聚糖，再刻蚀去除磺化聚苯乙烯模板从而制备了该具有pH敏感荧光肝靶向功能的聚电解质空心微球(CSFITC/HA)4/GC。其粒径约为260 nm，且动态光散射分析表明其具有pH及离子强度双重响应特性。经实验表明，该聚电解质空心微球具有pH敏感荧光、肝靶向功能及低细胞毒性。在此基础上，为了简化实验步骤，缩短实验周期，通过聚电解质共沉淀法将乳糖酸功能化壳聚糖与透明质酸钠构建成具有离子交换海绵结构的聚电解质纳米微球 GC/HA NPs。其粒径约为80 nm。该聚电解质纳米微球表面电荷可在中性条件或碱性条件下的负电荷翻转成在酸性条件下的正电荷，揭示了其在响应肿瘤组织外环境pH递送抗肿瘤药物方面的潜在应用。此外，该具有独特离子交换海绵结构的聚电解质纳米微球具有高的抗肿瘤药物阿霉素的药物负载容量及封装效率，及pH触发的药物释放。MTT实验及荧光显微镜分析揭示了阿霉素负载GC/HA NPs不仅拥有良好的生物相容特性，且具有高效的肝靶向功能。同时，我们还通过简单的离子（pH敏感），共价（还原敏感）双交联FA及Rh6G功能化透明质酸(FA-HA-Rh6G)制备了一种具有 pH/还原响应性荧光标记叶酸靶向的药物递送系统(DCL FA-HA-Rh6G NPs)。该药物递送系统能有效地负载抗肿瘤药物阿霉素(DLC及DEE分别为0.7161±0.0341 mg/mg及71.60％±3.4%))，且拥有在模拟肿瘤组织微环境条件下理想的释放行为。MTT实验及CLSM分析揭示了该双交联的透明质酸药物递送系统不仅具有良好的生物相容特性，而且能有效地实现对HeLa细胞的叶酸受体介导的靶向。　　其次，通过在壳聚糖骨架上引入PEG构建了该具有生物相容特性的PEG功能化壳聚糖基共聚物，该共聚物能在pH6.8的PBS中分子组装成胶束。基于该两亲性壳聚糖基胶束，通过调节壳聚糖的粘均分子量及PEG2000-CHO的接入量，构建了一系列可控形貌及粒径的DOX/CS-PEG胶束。此外，在PBS(pH7.4)下的DOX的累计释放量仅为2.68 wt%，而在PBS(pH5.0)下可达到72.76 wt%的累计释放量。该在正常生理条件下的稳定性及在弱酸性条件(pH5.0)下的暴释行为使得该DOX/CS100K-PEG2具有肿瘤微环境响应的“开关”阿霉素释放特性。MTT实验及 CLSM分析表明，该抗肿瘤药物递送系统可以有效地将抗肿瘤药物阿霉素递送进肿瘤细胞的细胞核，进而显著地抑制该肿瘤细胞。　　再次，我们联合原子转移自由基聚合，开环聚合，点击化学及酯基水解反应制备了一种能自组装成核-壳-冕型胶束的三嵌段共聚物(PEG43-b-P(AA30-co-tBA18)-b-PCL53)。该三嵌段共聚物通过二硫键交联后能有效的调控其药物释放行为，其粒径约为52 nm。该药物递送系统具有在正常生理条件下慢的阿霉素释放能力，而在模拟肿瘤组织条件下其具有快速的抗肿瘤药物释放能力。另外，生物毒性实验及 HepG2细胞增殖抑制实验共同揭示了该药物递送系统具有良好的生物相容特性，且阿霉素负载的该胶束具有与纯药阿霉素相媲美的抗肿瘤活性。同时，CLSM分析也证明了该结论。此外，通过原子转移自由基聚合、水解反应及酯化反应制备了一种具有光敏感性的两亲性共聚物 PEG43-b-P(AA76-co-NBAc35-co-tBA9)。在紫外辐照下该胶束的形貌转变赋予其良好的释放行为及其能通过触发进而增强阿霉素的递送效率。该共聚物胶束在365 nm紫外光下具有快速紫外响应特性，其光断裂反应可在二十分钟内完成。　　最后，氧化石墨烯二维纳米材料具有大的比表面积，大的苯环共轭体系及低细胞毒性，可以有效地通过π-π堆积作用负载具有苯环结构的抗癌药物小分子DOX。本工作中通过将叶酸端基化PEG共价修饰氧化石墨烯，使其具有叶酸靶向性，及进一步改善的低细胞毒性。实验证明，该药物递送系统具有高的阿霉素负载效率，且具有精确的肿瘤细胞靶向性。在此工作的基础上，发展了一种具有理想尺寸及形貌的氧化石墨烯纳米微球基药物递送系统，其通过二硫键将低细胞毒性的PEG功能化海藻酸钠共价耦联至氧化石墨烯基纳米微球表面，且其具有高效的药物递送能力。此外，该药物递送系统在血液循环中能防止其所负载的抗肿瘤药物的漏释，且其能在肿瘤微环境高浓度GSH下剥离脱落海藻酸层。同时，通过在 PEG功能化氧化石墨烯纳米微球表面铈引发自由基聚合甲基丙烯酸，再通过胱胺交联，首次报道了具有理想尺寸及分布的还原触发功能的氧化石墨烯纳米微球基药物递送系统。且该药物递送系统通过引入交联聚甲基丙烯酸壳层，从而减少了其在模拟正常组织条件下所负载的抗肿瘤药物阿霉素的漏释，且其能在模拟肿瘤组织还原剂存在下高效地释放所负载的抗肿瘤药物阿霉素。体外释放实验表明，该药物递送系统在pH5.0及10 mM GSH下的药物的累计释放量是在pH7.4及10μM GSH时的6倍。

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第一章 前言

1.1 纳米抗肿瘤药物递送系统的设计基础及发展

1.2内源性刺激

1.3外源性刺激

1.4 立题依据

参考文献

第二章 聚电解质微球基抗肿瘤药物递送系统

2.1引言

2.4 肝靶向递送阿霉素电荷翻转聚电解质纳米微球基抗肿瘤药物递送系统

2.4.2结果与讨论

2.5 具有 pH/还原响应触发释放的 pH 可调荧光叶酸介导靶向双交联透明质酸纳米微球基抗肿瘤药物递送系统

2.6本章结论

参考文献

第三章 超低漏释肿瘤微环境响应递送DOX的壳聚糖基药物递送系统

3.1引言

3.2 实验部分

3.3 抗肿瘤药物递送系统的制备

3.4实验结果及讨论

3.5本章结论

参考文献

第四章 两亲性共聚物基抗肿瘤药物递送系统

4.1 引言

4.2 实验试剂

4.3 基于三嵌段共聚物的还原响应性核-壳-冕胶束作为肿瘤微环境响应药物递送系统

4.4光响应性两亲性共聚物PEG43-b-P(AA-co-NBAc-co-tBA)的新型设计和制备及在抗癌药物阿霉素递送领域内的应用

4.5本章结论

参考文献

第五章 氧化石墨烯基抗肿瘤药物递送系统

5.1引言

5.2 实验部分

5.3叶酸靶向氧化石墨烯基抗肿瘤药物递送系统

5.4肿瘤微环境触发DOX释放的低细胞毒性氧化石墨烯纳米微球基抗肿瘤药物递送系统

5.5肿瘤特异性功能化氧化石墨烯纳米微球基抗肿瘤药物递送系统

5.6本章结论

参考文献

第六章 全文总结

在学期间的研究成果

致谢