miR-4284在缺氧条件下通过靶基因PRDX6调节人脐静脉内皮细胞的凋亡

摘要

目的:动脉硬化闭塞症(arteriosclerosis obliterans, ASO)是一种血管弥漫性疾病,是全球范围内心血管疾病发病率和死亡率居高不下的主要原因,严重危害人们身心健康.而内皮细胞参与ASO的病理形成的重要过程,在其发生、发展和预后中具有重要作用,但其分子机制尚不清楚.miRNAs通过结合靶基因参与细胞增殖、凋亡、迁移等多种功能的调控作用,在许多血管疾病中发挥调控重要作用.然而, miR-4284在动脉粥样硬化中的作用机制尚未被研究过.本研究旨在探讨miR-4284在动脉粥样硬化病理过程中对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)凋亡的作用.　　方法:采用RT-qPCR检测缺氧条件下miR-4284的表达水平.为了验证miR-4284对HUVECs功能的影响,我们在缺氧刺激条件下,转染miR-4284-mimic、阴性对照(NC)、miR-4284-inhibitor.首先,RT-qPCR检测转染效率;Hoechst-333342用于检测细胞凋亡;采用CCK-8法检测细胞活力的改变.然后,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2蛋白、Caspase3蛋白、Parp蛋白的表达变化,进一步实验探究miR-4284对人脐静脉内皮细胞凋亡影响的分子机制,试图找出其中隐藏的分子通路.Western blot检测通路蛋白P-Akt及Akt的表达,验证miR-4284影响HUVECs的凋亡通路是否激活.最后,我们通过靶基因预测软件预测了miR-4284相关靶基因,通过重重删选出最终靶基因,人工合成靶基因的RNA和蛋白引物,并进行靶基因的相关验证实验.缺氧刺激条件下,HUVECs中转染miR-42484-mimic、NC、miR-42484-inhibitor.RT-qPCR检测靶基因PRDX6表达变化.Western blot检测靶蛋白PRDX6表达变化.　　结果:为了删选出最佳缺氧模型,我们设置了缺氧时间梯度这一条件.我们得出缺氧处理后的HUVECs中,miR-4284表达明显上调,特别是缺氧处理4h后,miR-4284表达上调最明显(P<0.05).转染miR-4284-mimic后,HUVECs凋亡率明显升高(P<0.05),细胞活力明显受抑制(P<0.05),凋亡相关蛋白Bax蛋白、Parp蛋白、Caspase3蛋白表达上调(P<0.05),P-Akt及Akt蛋白表达下调(P<0.05);而转染miR-4284-inhibitor后,HUVECs凋亡率明显下降(P<0.05),细胞活力增加(P<0.05),凋亡相关蛋白Bax蛋白、Parp蛋白、Caspase3蛋白表达下调(P<0.05),P-Akt及Akt蛋白表达上调(P<0.05).使用生物信息学分析软件结果显示多个潜在的靶点,其中PRDX6成为我们最为关注的miR-4284的一个潜在的靶点.miR-4284-mimic可降低PRDX6 mRNA表达水平(P<0.05),miR-4284-inhibitor可诱导其表达(P<0.05).结果还显示,miR-4284-mimic可降低PRDX6蛋白表达水平,miR-4284-inhibitor可诱导其表达(P<0.05).　　结论:miR-4284在缺氧处理的HUVECs中表达上调.miR-4284表达增强可导致内皮细胞细胞凋亡,而miR-4284表达下调可部分减少缺氧引起的内皮细胞凋亡.生物信息学分析显示,PRDX6可能是HUVECs中miR-4284的一个重要靶基因.机制研究表明,miR-4284靶向PRDX6部分通过Akt通路诱导HUVECs凋亡.本研究最终得出miR-4284可能参与动脉粥样硬化发生和进展时血管内皮细胞的损伤,为临床治疗动脉粥样硬化提供新的潜在治疗靶点.

目录

前言

材料与方法

1 实验材料

2 主要实验试剂

2.1 细胞培养试剂

2.2 RT-qPCR主要试剂

2.3.转染、凋亡、CCK-8主要试剂

2.4 免疫印记试剂主要试剂

3 实验室设备

4 实验方法

4.1 细胞培养与传代

4.3 RNA提取和RT-qPCR分析

4.4 细胞凋亡实验

4.5 CCK-8 检测细胞活力

4.6 免疫印迹实验

4.7 数据分析

结果

1 RT-qPCR 检测缺氧条件下的人脐静脉内皮细胞miR-4284的表达

2 探究miR-4284对人脐静脉内皮细胞功能的影响

2.1 miR-4284对HUVECs凋亡的影响

3 凋亡相关标志蛋白的表达

4 探讨miR-4284是否通过Akt通路对人脐静脉内皮细胞进行调控

5 靶基因的选取与验证

讨论

1 miR-4284对ASO疾病有重要意义

2 miR-4284对人脐静脉内皮细胞的凋亡影响

3 miR-4284通过Akt通路对血管人脐静脉内皮细胞产生影响

4 miR-4284可能通过结合靶基因PRDX6从而产生调控作用

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:MicroRNA在血管内皮细胞损伤与动脉硬化闭塞症发生、发展中的作用机制

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