Bim与EGFR敏感突变的NSCLC吉非替尼一线治疗获得性耐药关系的研究

摘要

目的：旨在通过检测人肺腺癌吉非替尼获得性耐药细胞株PC9/GR和亲本细胞株PC9中的促凋亡蛋白Bim的表达,探讨吉非替尼一线治疗EGFR突变的肺腺癌获得性耐药是否与促凋亡蛋白Bim表达有关。　　方法：　　1.体外培养只存在EGFR19外显子突变、对吉非替尼敏感的人肺腺癌细胞株PC9及经人工诱导对吉非替尼耐药的细胞株PC9/GR,绘制两株细胞各自的生长曲线。　　2.使用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验检测吉非替尼对PC9及 PC9/GR细胞增殖能力的影响,Annerin-V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡，以此验证PC9及PC9/GR两株细胞对吉非替尼的敏感性及耐药性。　　3.Western blot（蛋白免疫印迹）方法检测PC9及PC9/GR细胞株中吉非替尼给药前后及不同作用时间促凋亡蛋白Bim表达变化趋势，以此来揭示促凋亡蛋白Bim与EGFR敏感突变的肺腺癌经吉非替尼一线治疗后获得性耐药的关系。　　结果：　　1.体外培养人肺腺癌细胞株(PC9、PC9/GR各两株)，连续7天每天分别测定两株细胞的OD值绘制生长曲线，结果见吉非替尼敏感细胞株PC9较吉非替尼耐药细胞株PC9/GR生长快。　　2.MTT实验结果提示吉非替尼能够抑制PC9细胞增殖，流式细胞术发现吉非替尼能够诱导PC9细胞凋亡，对PC9/GR细胞株进行同样的处理观察到，其抑制率及凋亡率均明显低于PC9细胞株。MTT实验发现吉非替尼作用24h及48h后PC9抑制率明显高于PC9/GR细胞株总抑制率（28.02±15.01%vs2.98±6.05%,t=13.535,p=0.000；32.55±15.80%vs25.88±8.01%，t=13.073，p=0.000），流式细胞术检测到吉非替尼作用48h后PC9总凋亡率高于PC9/GR细胞株（25.96±21.79%vs13.95±13.12%，t=6.315,p=0.003）。同时研究发现对吉非替尼的敏感细胞株增加吉非替尼浓度可加速细胞凋亡,对吉非替尼耐药的细胞株增加吉非替尼浓度细胞死亡现象不明显。　　3.Western blot结果发现：每个浓度吉非替尼作用下均表现为PC9的凋亡蛋白Bim浓度大于PC9/GR细胞株,吉非替尼作用24h后PC9与PC9/GR细胞株相比,Bim蛋白表达量增加明显（1.20±0.72vs0.64±0.19，t=3.232,p=0.032），作用48h后PC9/GR细胞株与PC9细胞株相比Bim蛋白减少（0.58±0.17vs1.55±0.94，t=6.116,p=0.004），差异具有统计学意义。　　结论：　　1.PC9细胞株较PC9/GR细胞株生长快。　　2.对吉非替尼耐药的PC9/GR细胞株中促凋亡蛋白Bim减少，对吉非替尼敏感PC9细胞株促凋亡蛋白Bim增加，说明凋亡蛋白Bim减少与EGFR突变的肺腺癌PC9细胞株经吉非替尼一线诱导发生的获得性耐药有关。

目录

声明

前言

1.材料

1.1.细胞株来源

1.2.设备和器材

1.3.实验主要试剂

1.4.溶液的配制

2．实验方法

2.1.体外培养人肺腺癌细胞株PC9及PC9/GR.

2.2.MTT法检测PC9及PC9/GR的敏感性及耐药性

2.3.Annexin V-FITC流式凋亡试剂盒检测细胞凋亡

2.4.Western blot法检测吉非替尼对PC9及PC9/GR细胞Bim蛋白表达的影响

2.5统计学方法

3.结果

3.1.高倍显微镜下观察PC9及PC9/GR细胞形态学

3.2.两组细胞生长曲线

3.MTT法检测PC9、PC9/GR细胞株对吉非替尼的抑制率

3.3.用流式细胞术分析吉非替尼对PC9及PC9/GR细胞株凋亡率的作用

3.5.Western blot法检测在不同吉非替尼浓度作用下PC9及PC9/GR细胞中Bim蛋白表达

4.讨论

5.结论

参考文献

文献综述:Bim与EGFR突变非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药的关系

缩 略 语 表

攻读学位期间发表文章情况

个人简历

致谢