不结球白菜的抗旱与抗寒特性、作用机制及抗寒关键基因CBF1的克隆与功能研究

摘要

干旱和低温胁迫是导致植物生长发育受阻和作物减产的重要环境因素。研究植物对干旱和低温的响应具有重要的理论意义和实践价值。
　　对小白菜的三个品系苏州青（BcL.1）、黄心乌菜(BcL.2)和黑心乌菜（BcL.3）对干旱和低温胁迫的耐受性进行了研究，主要研究结果如下:
　　1.黑心乌菜比苏州青和黄心乌菜更加耐寒，表现出较好的低温耐受性。低温胁迫后黑心乌菜的存活率明显高于苏州青和黄心乌菜（2-3倍），黑心乌菜的相对电导率明显低于苏州青和黄心乌菜，低温胁迫下黑心乌菜相对于前两者受到的伤害水平较低，植株组织的冻害较小。
　　2.黑心乌菜相对于苏州青和黄心乌菜对干旱胁迫更加耐受，黑心的存活率明显高于苏州青和黄心乌菜（2-3倍），单株离体实验表明，黑心乌菜叶片失水率明显小于苏州青和黄心乌菜。
　　3.为了研究黑心乌菜对低温、干旱胁迫耐受的机制，对三种植株体内可溶性糖含量进行检测，其胁迫处理后可溶性糖含量均有上升但三者之间无显著差异，表明黑心乌菜株系对低温、干早的耐受性可能与可溶性糖积累关系不大。
　　4.干旱处理后，植株体内脯氨酸含量均有上升，黑心乌菜中脯氨酸含量显著高于苏州青和黄心乌菜。但在低温胁迫下三种植株的脯氨酸含量无明差异。表明黑心乌菜对干旱胁迫的耐受性可能与脯氨酸积累有关。
　　5.为了进一步验证黑心乌菜抗旱和抗寒的机制，检测了胁迫下脯氨酸代谢途径上相关基因的表达，干旱处理后，黑心乌菜中脯氨酸合成关键基因P5CS表达水平明显上升，脯氨酸降解途径中PDH基因的表达与苏州青和黄心乌菜无显著差异，说明黑心乌菜中P5CS基因高度表达增加脯氨酸含量导致其对干旱胁迫的耐受。进一步检测P5CS酶活，也支持上述结论。而低温处理后，三种植株中P5CS和PDH在转录水平和P5CS酶活均无显著差异。
　　6.为了进一步研究黑心乌菜相对于苏州青和黄心乌菜对低温胁迫更加耐受的原因，检测了在低温胁迫下CBF/DREB1依赖的信号途径中相关基因的表达水平。结果表明在低温胁迫下，黑心乌菜中CBF/DREB1途径中关键基因CBF1在其上游调控因子LOS4和CBF自身调控因子CBF2调控下高度表达，激活其下游COR15A基因表达，使黑心乌菜具有比苏州青及黄心乌菜更强的抗寒性。
　　7.以黑心乌菜的cDNA为模板扩增BrCBF1基因全长，将该基因连接到pART27载体上。获得的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101，通过浸花转化法将BrCBF1重组载体转化到拟南芥野生型植株中，利用转基因筛选与遗传鉴定。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 实验材料简介

1．2 植物抗旱的研究进展

1．2．1 干旱胁迫对植物的影响

1．2．2 植物对干旱胁迫的响应

1．2．3 干旱胁迫下对其它生理过程的影响

1．2．4 植物抗旱的机制

1．3 植物抗寒的研究进展

1．3．1 低温逆境对植物的影响

1．3．2 冷信号的感知和转导

1．3．3 冷信号的响应

1．4 脯氨酸：一种多功能氨基酸

1．4．1 脯氨酸在植物体内的积累

1．4．2 植物中脯氨酸的代谢

1．5 CBF1基因的研究进展与研究意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株与质粒

2．2 主要试剂

2．2．1 常用分子生物学试剂盒

2．2．2 常用酶类

2．2．3 常用生化试剂

2．2．4 常用溶液与试剂的配制

2．3 主要仪器与设备

2．4 实验方法

2．4．1 灭菌方法

2．4．2 实验中植株的种植和培养

2．4．3 大肠杆菌DH5α菌株感受态的制备过程

2．4．4 农杆菌GV3101感受态的制备

2．4．5 质粒DNA提取(Kit)

2．4．6 重组载体的构建

2．4．7 植物基因组DNA的提取(CTAB法)

2．4．8 基因定量qRT-PCR

2．4．9 实验中定量引物

2．4．10 游离脯氨酸的测定方法

2．4．11 可溶性糖的测定

2．4．12 植株的干旱和低温胁迫

2．4．13 离体植株、叶片的失水率测定

2．4．14 低温胁迫下电导率的测定

2．4．15 低温胁迫下叶绿素的测定

2．4．16 P5CS酶活力测定

2．4．17 实验数据统计分析及处理

第三章 实验结果与分析

3．1 苏州青、黄心乌菜和黑心乌菜生长不同时期发育表型

3．2 黑心乌菜相对于苏州青和黄心乌菜对低温胁迫更加耐受

3．2．1 苏州青、黄心乌菜和黑心乌菜对低温胁迫的响应

3．2．2 苏州青、黄心乌菜和黑心乌菜在低温胁迫下的存活率和电导率

3．3 黑心乌菜相对于苏州青和黄心乌菜对干旱胁迫更加耐受

3．3．1 苏州青、黄心乌菜和黑心乌菜对干旱胁迫的响应

3．3．2 苏州青、黄心乌菜、黑心乌菜干旱存活率和失水率

3．4 黑心乌菜体内脯氨酸积累导致对干旱胁迫的耐受

3．4．1 低温、干旱胁迫下苏州青、黄心乌菜和黑心乌菜体内可溶性糖含量

3．4．2 低温、干旱胁迫下苏州青、黄心乌菜和黑心乌菜体内脯氨酸含量

3．6 低温、干旱胁迫下脯氨酸代谢途径相关基因表达

3．7 低温、干旱胁迫下P5CS酶活的测定

3．8 低温胁迫下CBF途径相关基因表达

3．9 35S：BrCBF1转化拟南芥转基因株系的获得

3．9．1 BrCBF1基因过表达载体构建

3．9．2 BrCBF1基因过表达转基因株系的筛选与鉴定

3．10 BrCBF1基因拟南芥转基因植株的发育表型

第四章 讨论与展望

4．1 结果与讨论

4．2 后续工作展望

参考文献

攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况