ampC与喹诺酮类靶位基因突变在耐多药大肠埃希菌中的探讨

摘要

目的:了解泸州地区大肠埃希菌(Escherichia coli，E.coli)携带ampC基因及耐喹诺酮类突变靶位基因的情况，并对二者的相关性进行探讨;同时分析携带突变基因的菌株对喹诺酮类抗菌药物的耐药情况，为临床治疗耐多药菌株的合理选择抗菌药物提供理论依据。　　方法:1.PCR技术:使用细菌基因组DNA提取试剂盒按使用说明提取细菌基因组DNA用作PCR反应模板。5对引物进行扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并于254nm波长的紫外灯下用图像处理器照相。2.基因测序:将PCR产物进行胶回收，回收产物用核酸定量仪测DNA浓度合格（大于300ng/μl）后，送至上海生工技术公司进行基因测序。3.药物敏感试验:3.1鉴定高产AmpC酶菌株:经过检测菌株对头孢西丁的抑菌环≤18mm为可疑产AmpC酶菌株，再通过头孢西丁三维试验方法，通过检测大肠埃希菌的β-内酰胺酶能否水解头孢西丁（蚀环现象）来确证产酶菌株。3.2纸片扩散法(Kerby-Bauer，K-B):测定临床分离株大肠埃希菌对氧氟沙星(OFX)、洛美沙星(LOM)、环丙沙星(CIP)、萘啶酸(NA)、诺氟沙星(NOR)、头孢西丁(FOX)、头孢噻肟(CTX)、头孢吡肟(FEP)、氨曲南(ATM)、亚胺培南(IPM)、链霉素(S)、庆大霉素(GEN)等抗菌药物的敏感性。　　结果:1.ampC基因携带:71株大肠埃希菌检出ampC基因阳性61株(85.92％)。2.喹诺酮靶位基因突变:选出5种基因电泳均见清晰条带的55株菌株的基因产物进行测序比对，GyrA亚基49株出现S83L位氨基酸替换、36株出现D87N位氨基酸替换;GyrB亚基3株出现基因突变但未出现氨基酸替换;ParC亚基34株出现S80I替换及8株A56P替换;ParE亚基6株出现E84G替换、4株A426V替换及3株S458A替换。同时存在ampC基因阳性且喹诺酮类靶位基因突变菌株有51株(92.72％)。3.产AmpC酶情况:61株ampC基因阳性株中有10株(16.39％)对头孢西丁药敏纸片抑菌环≤18mm。确证产AmpC酶菌株8株(13.11％)。4.药敏结果:(1)实验菌株对亚胺培南敏感性最高，达100％，其次是头孢西丁、头孢吡肟、氨曲南等抗菌药物，而较低的是部分喹诺酮类抗菌药物及头孢噻肟、庆大霉素、链霉素等。(2) ampC基因阳性菌株对NA、NOR、OFX三种抗菌药物的耐药率高于ampC基因阴性菌株(P＜0.05)。高产AmpC酶对CIP的耐药率高于非产AmpC酶菌株(P＜0.05)。(3)55株测序菌株中，耐多药大肠埃希菌有21株(38.18％)，其中同时存在ampC基因阳性且喹诺酮类靶位基因出现突变的菌株占71.43％，产AmpC酶菌株占38.10％。另外，菌株对喹诺酮类药物的交叉耐药现象也比较常见，耐三种及以上喹诺酮类抗菌药物的菌株有22株(40％)。(4)耐多药菌株中突变耐药位点与双耐药相比较差距不大，但不同的是出现了ampC阳性联合gyrA+parC+parE基因的突变，而全敏和单耐菌株仅表现为单个耐药位点的突变。　　结论:1.本地区临床分离的大肠埃希菌中携带ampC基因的菌株常见(85.92％)，且在耐多药菌株中占90.48％，高产AmpC酶菌株相对较少(11.27％)，但主要分布在耐多药大肠埃希菌中。2.喹诺酮类靶位基因突变情况在临床分离株中常见，多位点突变以gyrA联合parC基因的突变为主，耐多药菌株中，多位点突变以ampC阳性联合gyrA及parC基因的突变为主。3.ampC基因检出阳性菌株对萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星耐药性高于ampC基因检出阴性菌株，高产AmpC酶菌株对环丙沙星的耐药率高于非产AmpC酶菌株。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法

结果

1 ampC基因的检测

2 gyrA、gyrB、parC、parE基因检测

3 检测ampC基因阳性菌株产AmpC酶情况

4 药敏结果

5 ampC基因阳性菌株对5种喹诺酮类抗菌药物耐药情况

6 产AmpC酶菌株对5种喹诺酮类抗菌药物耐药情况

讨论

1 大肠埃希菌携带ampC基因及产AmpC酶情况

2 ampC基因阳性及高产AmpC酶菌株对喹诺酮类抗菌药物耐药情况

3 喹诺酮类靶位基因突变情况

4 菌株耐药模式与基因突变的关系

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述 AmpC β-内酰胺酶致细菌耐药机制的研究进展

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