PTH-FC对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及骨向分化的影响

摘要

目的：　　评价PTH-FC(Parathyroid Hormone-Fc)对大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)骨向分化的作用，筛选出PTH-FC诱导BMSCs成骨分化最佳的作用浓度和时间；　　方法：　　采用全骨髓直接贴壁法体外分离、培养SD大鼠BMSCs；分别用细胞流式术检测细胞表面标志物的表达和细胞成骨、成脂的分化能力鉴定培养的细胞是否为BMSCs；以不同浓度的PTH-FC作用于BMSCs研究其对BMSCs增殖及骨向分化的作用。分别以含 PTH-FC10-7M （mol/L ）、PTH-FC10-8M、PTH-FC10-9M 正 常 培 养 液 作 用 BMSCs ，通 过 噻 唑 兰(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)、 碱性磷 酸酶(Alkaline phosphatase,ALP）、茜素红染色筛选出PTH-FC作用于BMSCs最佳的作用浓度；以PTH-FC最佳浓度的成骨诱导液分别诱导BMSCs作用6 h（间歇性给药）和48 h（持续性给药）通过MTT、 ALP、茜素红染色和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time fluorescence quantiative PCR,qRT-PCR)检测Runx2 （Runt-related transcription factor 2）、OPN（Osteopontin）、ALP mRNA的表达观察PTH-FC作用于BMSCs的最佳的促增殖、促骨向分化的作用。　　结果:　　1.采用全骨髓直接贴壁法成功的分离培养了BMSCs；细胞流式技术检测细胞表面标志物的表达：CD34和CD45呈阴性表达，其阳性表达率分别为1.85%和1.30%；CD90和CD44的阳性表达率分别为96.69%和99.82%，证明细胞来源于骨髓间充质。经成骨、成脂诱导液诱导21d后，茜素红和油红O染色可见明显的钙结节和脂滴，表明培养的细胞为干细胞，其有多项分化的潜能；　　2.分别以含PTH-FC10-7 M、PTH-FC10-8 M、 PTH-FC10-9 M正常培养液作用BMSCs，通过MTT可知PTH-FC促进BMSCs的增殖，1 d、2 d时PTH-FC对BMSCs的增殖效果不明显，从第3 d起PTH-FC10-9 M促进BMSCs增殖的效果明显；通过ALP、茜素红染色可知PTH-FC10-9 M促进BMSCs的骨向分化，与对照组比较其作用不明显(P＞0.05)；筛选出PTH-FC作用于BMSCs最佳的作用浓度为PTH-FC10-9 M；　　3.含PTH-FC10-9 M的成骨诱导培养液作用6 h的间歇性给药组，与其他组相比，PTH-FC10-9 M的成骨培养液作用6 h对BMSCs具有较高的骨向分化能力，即ALP表达显著升高，茜素红染色显示更多的钙化结节，qRT-PCR检测Runx2、OPN、ALP mRNA的表达明显高于对照组，其具有统计学意义（P＜0.05）；细胞增殖能力（MTT）结果表明各实验组组间无显著差异(P＞0.05)。　　结论：　　1.全骨髓直接贴壁法是一种简单有效并且能获得较高纯度BMSCs的分离方法，其分离的细胞具有多向分化潜能；　　2.PTH-FC10-9M作用BMSCs 6h的间歇性给药组具有最佳的骨向诱导能力，这提示PTH-FC作为骨诱导生长因子联合BMSCs对骨组织缺损的修复是可行的。

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第一章 绪 论

1.1 目前临床上修复骨组织缺损的方法

1.2 目前临床上常用的促成骨药物

1.4 BMSCs的简介及其在临床上的应用前景

1.4.1 BMSCs简介

1.4.2 BMSCs在临床上的应用前景

1.5 选题依据和研究思路

随着经济水平的发展和种植技术的不断提高，很多牙列缺损或缺失的患者把种植治疗作为修复牙齿缺失的第一选择

本实验的研究思路如下：

1.采用全骨髓直接贴壁法分离、培养SD大鼠BMSCs；分别用流式术检测细胞表面标志物的表达和细胞向成

2.以不同浓度的PTH-FC作用于BMSCs研究其增殖及骨向分化的作用。分别以含PTH-FC10-7

3.以PTH-FC最佳浓度的成骨诱导液分别诱导BMSCs作用6 h（间歇性给药）和48 h（持续性给

第二章 大鼠BMSCs的原代培养和鉴定

2.1 引言

目前关于大鼠BMSCs体外分离培养的方法主要有全骨髓直接贴壁法

关于对BMSCs体外分离培养不同的首次换液的时间对细胞的纯度及活力影响的研究中，众多学者有不同的观点

2.2 实验材料及方法

油红0染色液

2.2.2 主要实验仪器

（1）成骨诱导液的配置

（2）成脂诱导液的配置

2.2.4 实验方法

2.3 结果

第三章 最佳浓度PTH-FC的筛选

4.3 实验结果

4.4本章小结