左归丸加减方对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化影响的实验研究

摘要

目的： 观察左归丸加减方对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(Mcscnchymal Stem Cells，MSCs)增殖和向成骨细胞分化的影响。 方法： 1.运用全骨髓法(贴壁筛选法)分离和培养大鼠MSCs并进行鉴定； 2.制备高中低浓度的左归丸加减方含药血清，用MTT法检测左归丸加减方含药血清对MSCs增殖的影响，了解量效关系； 3.用不同浓度的左归丸加减方含药血清诱导MSCs向成骨细胞(osteoblast，OB)分化，分高浓度左归丸加减方组、中浓度左归丸加减方组、低浓度左归丸加减方组、经典诱导组和空白对照组共五组； 4.用Von-Kossa染色对加入不同浓度左归丸加减方含药血清诱导后的细胞进行染色，确定左归丸加减方含药血清对MSCs是否具有成骨诱导作用； 5.运用免疫细胞化学方法检测Ⅰ型胶原的表达，并进行灰度分析，确定左归丸加减方含药血清对MSCs是否具有骨向诱导分化作用。 结果： 1.MSCs分离后基本贴壁，12～15d达到融合； 2.流式细胞仪检测结果显示，第三代MSCs中G0/G1期的细胞为96.7％，G2期的细胞为1.2％，S期的细胞为2.1％；低表达CD29，高表达CD44和CD105，不表达CD34，CD45，CD19，符合骨髓间充质干细胞特征； 3.与空白对照组相比，不同浓度的左归丸加减方含药血清均能促进MSCs增殖，并且其作用呈量效依赖关系(P<0.05)； 4.加入不同浓度左归丸加减方含药血清诱导21d后，经Von-Kossa染色均能观察到黑色的矿化结节； 5.与空白对照组相比，除低浓度左归丸加减方含药血清诱导第7d对Ⅰ型胶原平均灰度的表达没有明显影响外(P>0.05)，不同浓度左归丸加减方含药血清对Ⅰ型胶原平均灰度的表达均有上调作用(P<0.05)。 结论： 高中低浓度左归丸加减方含药血清均具有促进MSCs增殖的作用，并呈量效依赖关系。各浓度左归丸加减方含药血清均能显著诱导其向成骨细胞(OB)分化，故左归丸加减方能够防治骨质疏松症，其可能机制是通过促进MSCs增殖或者直接诱导向成骨细胞(OB)分化，从而增强MSCs的骨向分化能力。

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文摘

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论文说明：缩略词

声明

前言

第一部分MSCs的分离、培养、纯化和鉴定

1研究目的

2实验材料

2.1实验动物

2.2主要试剂和仪器

3实验方法

3.1大鼠MSCs的分离与培养

3.2传代与纯化

3.3细胞活性的检测

3.4 MSCs的鉴定

4结果

4.1倒置显微镜观察结果

4.2细胞周期

4.3 MSCs的表型测定

4.4生长曲线

4.5诱导分化后成骨细胞鉴定

5讨论

5.1 MSCs的分离培养

5.2 MSCs的生物学特性

5.3 MSCs的鉴定

6小结

第二部分左归丸加减方对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化的影响

1研究目的

2实验材料

2.1实验动物

2.2主要试剂

2.3主要设备和仪器

2.4左归丸加减方水煎液的制备

3实验方法

3.1左归丸加减方含药血清的制备

3.2 MTT法检测左归丸加减方含药血清对MSCs增殖的影响

3.3诱导MSCs向成骨细胞分化

3.4骨向诱导后细胞Von-Kossa染色

3.5骨向诱导后免疫细胞化学检测

3.6统计学方法

4结果

4.1加入各干预液后的形态变化

4.2细胞增殖效应测定

4.3 Von-Kossa染色结果

4.4免疫细胞化学检测

5讨论

6小结

结论

展望

参考文献

附录

致谢