声明
第1章 前 言
1.1 肠毒素与宿主相互作用的研究现状
1.2 产气荚膜梭菌研究进展
1.2.1 产气荚膜梭菌概述
1.2.2 产气荚膜梭菌基因型及产毒类型概述
1.2.3 产气荚膜梭菌的生长与繁殖
1.3 ETX的研究进展
1.3.1 ETX 的产生
1.3.2 ETX 的活化方式及特点
1.3.3 ETX 的结构特点及作用机理
1.3.4 ETX 的假定受体
1.3.5 ETX 与动物疾病的关系
1.4 三叶因子研究进展
1.4.1 三叶因子概述
1.4.2 三叶因子的作用机制
1.4.3 三叶因子待解决的问题
1.5 科学问题
1.6 课题研究意义
第2章 生物信息学分析
2.1 实验工具
2.2 实验方法
2.2.1 同源结构域蛋白的查找
2.2.2 分子对接
2.2.3 序列比对
2.3 结果与分析
2.3.1 ETX 保守结构域类似蛋白在自然界中广泛存在
2.3.2 分子对接表明ETX 和 TFF 具有相互结合的结构基础
2.3.3 预测的相互作用氨基酸残基在不同物种中的保守性有差异
2.4 讨论
第3章 蛋白表达与纯化
3.1 实验材料
3.1.1 实验试剂
3.1.2 仪器设备
3.1.3 菌株来源
3.2 实验方法
3.2.1 产气荚膜梭菌的培养及菌株保存
3.2.2 革兰氏染色
3.2.3 天然ETX 蛋白（proETX，在本文简称proETX）的粗提
3.2.4 银染
3.2.5 BCA 蛋白定量
3.2.6 胰酶切割proETX 蛋白
3.2.7 重组载体的构建
3.2.8 原核表达与纯化
3.3 结果与分析
3.3.1 从C58-1 菌株中纯化得到proETX 蛋白
3.3.2 原核表达与纯化获得重组ETX（rETX，在本文简称rETX）蛋白
3.3.3 原核表达与纯化获得重组人源TFF2 和TFF3（rhTFF2、rhTFF3，在本文简称rhTF2、rhTFF3）蛋白
3.3.4 原核表达与纯化获得载体标签Trx 蛋白
3.4 讨论
第4章 蛋白活性检测
4.1 实验材料
4.1.1 实验试剂
4.1.2 仪器设备
4.1.3 细胞来源
4.2 实验方法
4.2.1 细胞培养
4.2.2 细胞冻存
4.2.3 细胞毒性测试
4.2.4 数据处理
4.3 结果与分析
4.3.1 ETX 对MDCK 细胞有毒性
4.4 讨论
第5章 rhTFF2和rhTFF3在细胞水平对rETX的生物学功能影响
5.1 实验材料
5.1.1 实验试剂
5.1.2 仪器设备
5.2 实验方法
（1）MTS 法
（2）红细胞溶血实验
（3）免疫荧光
5.3 结果与分析
5.3.1 rhTFF2 可促进rETX 在MDCK 细胞中的毒性
5.3.2 rhTFF3 可促进rETX 在MDCK 细胞中的毒性
5.3.3 Trx 蛋白对rETX 在MDCK 细胞中的毒性无影响
5.3.4 rETX 会引起人红细胞溶血
5.3.5 rhTFF2 蛋白对rETX 引起的人红细胞溶血无影响
5.3.6 rhTFF3 蛋白对rETX 引起的人红细胞溶血无影响
5.3.7 Trx 蛋白对rETX 引起的人红细胞溶血无影响
5.3.8 rETX 和rhTFF2、rhTFF3 在MDCK 细胞上可以共定位
5.4 讨论
第6章 体外检测rhTFF2和rhTFF3与rETX蛋白的相互作用
6.1 实验材料
6.1.1 实验试剂
6.1.2 仪器设备
6.2实验方法
6.2.1 斑点杂交
6.3 结果与分析
6.3.1 斑点杂交发现rhTFF2 和rhTFF3 与rETX 不结合
6.4 讨论
第7章 结论与展望
7.1 结论
7.2 进一步工作的方向
致谢
参考文献
附录 密码子优化后碱基序列
攻读学位期间的研究成果
南昌大学;
