鸡胚抗氧化蛋白的分离纯化及性质研究

摘要

鸡胚蛋作为一种民间传统食补珍品在清朝成丰年间就有食用的习惯，其营养丰富，效用价值高，是营养、进补治病的佳品。随着人们对健康的重视，对食源性抗氧化剂的研制越来越受到重视。鸡胚蛋白是鸡胚中一种重要的活性物质，它不仅是鸡胚生命活动的重要物质，而且具有独特的抗皱抗氧化功能，因而对鸡胚蛋白中具有抗氧化作用的蛋白进行分离纯化就有重要的意义。 本文以孵化15 d的鸡胚蛋为原料，采用乙醚低温回流脱去鸡胚干粉中脂肪，缓冲液法提取鸡胚蛋中的蛋白，在单因素的基础上，选取料液比、提取温度、提取时间，应用Box-Behnken中心组合实验设计建立数学模型，以蛋白提取率为指标，确定鸡胚蛋白最佳提取条件，再通过离子交换色谱法、葡聚糖G-100凝胶过滤层析法对鸡胚蛋白中抗氧化能力较强的蛋白进行分离纯化，最后通过动物体内实验验证抗氧化蛋白的活性。
　　首先通过差示扫描量热仪(DSC)确定粗蛋白的变性起始温度。在单因素的基础上，选取料液比、提取温度、提取时间，应用Box-Behnken中心组合实验设计建立数学模型，以蛋白提取率为指标，得出最佳提取条件为料液比1∶16、温度为50℃、时间116 min，在预测优化条件下进行3次验证实验，得到鸡胚蛋白提取率为73.87％。
　　再次，对鸡胚蛋白进行分离纯化。在最佳条件下提取的鸡胚蛋白通过DEAE-纤维素-52阴离子交换色谱法分离出四个组分:命名为P1;P2;P3;P4。采用二苯代苦味酰基(DPPH·)、超氧阴离子(O2-·)、羟自由基(·OH)进行体外抗氧化蛋白活性实验，评价各个组分抗氧化活性。将抗氧化性较高的组分采用葡聚糖G-100凝胶过滤层析法对分离组分进一步纯化，得到鸡胚抗氧化蛋白P4-1组分。LC-MS检测分析得到抗氧化蛋白P4-1中包含386个氨基酸，等电点为5.07。SDS-PAGE电泳观察P4-1分子量为45.0 kDa。通过氨基酸组成的测定，P4-1中氨基酸种类齐全，富含17种氨基酸（色氨酸在盐酸水解时被破坏未检出），7种必需氨基酸。通过差示扫描量热仪(DSC)分析得到P4-1变性温度在46.59-67.00℃之间，熔点为57.16℃，热焓(△H)为0.9183 J/g。
　　最后考察温度、pH、NaCl、金属离子对抗氧化蛋白活性的影响并研究了抗氧化蛋白在小鼠体内的体内活性。结果表明温度在30-50℃之间时，P4-1清除羟自由基(·OH)的能力较稳定，而随着温度的升高，P4-1清除羟自由基(·OH)的能力开始下降，最后再次趋于平稳。P4-1清除羟自由基(·OH)的能力随着pH值的增加而减小，NaCl浓度在0-4％时，抗氧化蛋白对羟自由基清除率保持相对稳定，当浓度超过4％时，羟自由基清除率明显下降，而金属离子对抗氧化蛋白的活性具有一定的抑制作用。
　　通过动物实验发现抗氧化蛋白在小鼠体内具有良好的抗氧化能力，能够降低MDA的含量，提高SOD和GSH-Px、T-AOC的活力，且实验组各小鼠高剂量灌胃组明显高于低剂量组。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 鸡胚蛋概述

1．1．1 鸡胚

1．1．2 鸡胚产品开发现状

1．1．3 鸡胚蛋白

1．2 蛋白质提取分离、纯化的方法

1．2．1 动物组织蛋白提取分离

1．2．2 蛋白纯化方法

1．3 抗氧化性蛋白

1．3．1 自由基的危害

1．3．2 抗氧化剂在食品工业中的应用

1．3．3 抗氧化蛋白的研究现状

1．4 研究目的与技术路线

1．4．1 研究目的及意义

1．4．2 研究技术路线

1．4．3 研究内容

第二章 鸡胚蛋白提取工艺优化及抗氧化研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．3 主要试剂、仪器及设备

2．3．1 主要试剂

2．3．2 仪器及设备

2．4 实验技术路线

2．5 实验方法

2．5．1 鸡胚粗蛋白含量

2．5．2 鸡胚粗蛋白的变性温度

2．5．3 鸡胚粉中可溶性蛋白提取率测定

2．5．4 鸡胚蛋白提取单因素实验

2．5．5 响应面法优化鸡胚蛋白提取工艺

2．5．6 鸡胚蛋白的氨基酸组成

2．5．7 鸡胚蛋白抗氧化活性研究

2．6 数据处理

2．7 结果与分析

2．7．1 牛血清白蛋白标准曲线

2．7．2 鸡胚粗蛋白热变形温度测定结果

2．7．3 鸡胚蛋白优化提取单因素实验结果

2．7．4 鸡胚蛋白的提取工艺优化

2．7．5 鸡胚蛋白水溶液的抗氧化活性

2．7．6 鸡胚蛋白氨基酸分析

2．8 本章小结

第三章 鸡胚抗氧化蛋白的分离纯化

3．1 引言

3．2 主要试剂、仪器和设备

3．2．1 主要试剂

3．2．2 仪器和设备

3．3 实验方法

3．3．1 粗蛋白的硫酸铵沉淀

3．3．2 离子交换色谱法

3．3．3 体外抗氧化实验

3．3．4 凝胶过滤色谱

3．3．5 抗氧化蛋白的SDS-PAGE检测鉴定

3．3．6 液相质谱分析

3．3．7 氨基酸分析

3．3．8 抗氧化蛋白的变性温度

3．4 结果与分析

3．4．1 离子交换色谱法初步分离

3．4．2 凝胶层析分离纯化抗氧化蛋白

3．4．3 纯化组分的蛋白质含量

3．4．4 抗氧化蛋白的SDS-PAGE检测鉴定

3．4．5 抗氧化蛋白的质谱鉴定结果

3．4．6 抗氧化蛋白的氨基酸分析

3．4．7 抗氧化蛋白的变性温度

3．5 本章小结

第四章 鸡胚抗氧化蛋白的活性研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．3 主要试剂、仪器及设备

4．4 实验方法

4．4．1 ·OH 自由基清除活性的测定

4．4．2 温度对抗氧化蛋白活性的影响

4．4．3 pH对抗氧化蛋白活性的影响

4．4．4 NaCl对抗氧化蛋白活性的影响

4．4．5 金属离子对抗氧化蛋白活性的影响

4．4．6 体内抗氧化活性的研究

4．5 结果与分析

4．5．1 温度对抗氧化蛋白活性的影响

4．5．2 pH对抗氧化蛋白活性的影响

4．5．3 NaCl对抗氧化蛋白活性的影响

4．5．4 金属离子对抗氧化蛋白活力的影响

4．5．5 体内抗氧化活性研究结果

4．6 结论

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 论文的创新点

5．3 展望

参考文献

攻读硕士期间的研究成果