代谢工程改造酿酒酵母合成VD3关键中间体胆甾-5,7,24-三烯醇

目录

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第一章 绪论

1.1课题背景

1.2维生素D3合成工艺介绍

1.2.1化学合成法

1.2.2微生物转化法

1.2.3微生物代谢工程法

1.3代谢工程改造酿酒酵母合成关键中间体应用实例

1.4酿酒酵母甾醇合成代谢改造研究进展

1.5本研究立题意义

第二章 酿酒酵母erg5，erg6 单基因缺失株及erg5，erg6 双基因缺失株构建

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 菌株及常用质粒载体

2.2.2 常用酶及试剂

2.2.3 培养基

2.2.4 主要实验设备及仪器

2.2.5 引物

2.3 方法

2.3.1 酿酒酵母的培养

2.3.2 Cre-loxP 体系敲除目的基因

2.3.3 酿酒酵母基因组提取

2.3.4 酿酒酵母电转感受态制备

2.3.5 敲除组件的转化

2.3.6 OD值的测量

2.3.7 甾醇的提取

2.3.8 GC-MS 分析产物

2.4 结果与讨论

2.4.1基因敲除组建的构建

2.4.2突变株的转化，筛选及验证

2.4.3突变株的生理特性及代谢产物分析

2.4.4不同培养时间下双基因缺失株的三烯醇产量

2.5本章小结

第三章 ERG1，ERG11，tHMG基因在野生型BY4741及erg5缺失突变株的过表达

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 菌株及质粒载体

3.2.2 常用酶及试剂

3.2.3 培养基

3.2.4 主要实验设备及仪器

3.2.5 引物

3.3 方法

3.3.1 大肠杆菌质粒的提取

3.3.2 PCR 体系

3.3.3氯化钙法制备BL21感受态

3.3.4酿酒酵母醋酸锂化学转化感受态制作

3.3.5质粒转化酿酒酵母醋酸锂法感受态

3.4 结果与讨论

3.4.1 ERG1，ERG11，tHMG基因的克隆

3.4.2 ERG1，ERG11，tHMG过表达载体的构建

3.4.3过表达载体转化BY4741及erg5缺失突变株

3.4.4突变株的生理特性及代谢产物分析

3.5本章小结

第四章 全局调控因子Upc2p 对甾醇合成代谢影响的研究

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 菌株及质粒载体

4.2.2 常用酶及试剂

4.2.3 培养基

4.2.4 主要实验设备及仪器

4.2.5 引物

4.3 方法

4.3.1 BL21 电转感受态的制备

4.3.2 NADH/NAD+测定

4.4 结果与讨论

4.4.1转录因子的克隆

4.4.2 Upc2p过表达载体的构建

4.4.3过表达载体转化BY4741及erg5缺失突变株pYES2-upc2-1转化至Δerg5：

4.4.4突变株的生理特性及代谢产物分析

4.5本章小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

致 谢

作者简介

1. 作者简介

2. 攻读工学硕士期间发表的学术论文

3. 发明专利

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