黄芪联合间质干细胞对大鼠缺氧缺血性脑损伤修复作用及两种不同移植途径的比较研究

摘要

目的：　　观察黄芪注射液联合大鼠骨髓间质干细胞（rat mesenchymal stem cells,rMSCs）移植以及两种不同移植途径对大鼠缺氧缺血性脑损伤神经功能恢复的影响，以促进间质干细胞研究向临床应用转化，为间质干细胞早日应用于小儿复杂神经系统疾病的治疗提供科学依据，并为中医药在这一领域的研究和应用进行有益的探索。　　方法：　　以Rice方法制作缺氧缺血性脑损伤大鼠模型，按实验目的不同分两部分进行。　　1.黄芪联合rMSCs移植对缺氧缺血性脑损伤大鼠的治疗：造模后3d治疗组经脑局部注射经BrdU标记的rMSCs(2.5-5×105cell)，或同时腹腔注射黄芪注射液(1.2ml/100g)，对照组则仅注射黄芪注射液或脑局部注射PBS液。　　2.两种不同移植途径对rMSCs修复缺氧缺血性脑损伤作用的比较研究：造模后3d治疗组经脑局部注射经BrdU标记的rMSCs（2.5-5×105cell）或尾静脉注射经BrdU标记的 rMSCs（5-6×106cell）或同时腹腔注射黄芪注射液(1.2ml/100g)，对照组则经脑局部或尾静脉注射PBS液。两部分大鼠均在造模后24d或移植后21d行Morris水迷宫行为学试验检测大鼠学习、记忆能力，进一步取脑组织作HE染色观察脑损伤病理改变和修复情况，应用双标免疫组化技术检测经BrdU标记的rMSCs的胶质纤维酸性蛋白（glial fibriallary acidicprotein,GFAP）和神经原特异性烯醇化酶（Neuron Specific Enolase，NSE）表达情况。　　结果：　　大鼠造模存活率为93.44％。　　1.黄芪联合rMSCs移植对缺氧缺血性脑损伤大鼠的治疗：在Morris水迷宫试验中，脑rMSCs加黄芪组在各时间点的平均潜伏期均低于脑rMSCs组，除第1、6d两者平均时间无显著性差异（P＞0.05）外，其余各个时间点均有显著性差异（P＜0.05）；穿越平台次数高于脑rMSCs组，但无显著性差异（P＞0.05）。脑组织病理切片观察到脑rMSCs加黄芪组较脑rMSCs组的脑组织水肿和炎性细胞浸润减轻更明显，胶质细胞增生更活跃。双标免疫组化显示脑rMSCs加黄芪组中GFAP、NSE阳性细胞数目均较脑rMSCs组增多，并有显著性差异（P＜0.05）。　　2.两种不同移植途径对rMSCs修复缺氧缺血性脑损伤作用的比较研究：大鼠Morris水迷宫行为学检测结果示不同移植途径之间潜伏期平均时间比较，除第1d尾rMSCs组高于脑rMSCs组、尾rMSCs加黄芪组低于脑rMSCs加黄芪组，第5d尾rMSCs组低于脑rMSCs组，且有显著性差异（P＜0.05）外，其余时间点各组均无显著性差异（P＞0.05）；脑rMSCs组穿越平台次数高于尾rMSCs组，脑rMSCs加黄芪组穿越平台次数高于尾rMSCs加黄芪组，但均无显著性差异（P＞0.05）。脑组织病理切片观察到两种移植途径治疗效果相似。双标免疫组化则显示两种移植途径的大鼠脑组织内都可见BrdU标记的阳性rMSCs存活，并且经静脉移植的细胞分布相对广泛；脑局部移植的细胞随着时间的推移不断迁移；脑rMSCs组GFAP、NSE阳性细胞数较尾rMSCs组多，但无显著性差异（P＞0.05）；加用黄芪后脑定位移植途径的GFAP、NSE阳性细胞数显著高于尾rMSCs加黄芪组（P＜0.05）。　　结论：　　对大鼠缺氧缺血性脑损伤模型采用黄芪注射液联合脑局部 rMSCs移植后，与脑 rMSCs组相比，大鼠的学习、记忆能力有所改善，脑组织病理显示受损脑组织恢复更明显，双标免疫组化显示GFAP、NSE阳性细胞数显著增多，提示黄芪注射液能够在体内诱导rMSCs向神经细胞分化，同时具有协同MSCs修复损伤脑组织的作用。采用经脑定位和静脉两种不同rMSCs移植途径治疗缺氧缺血性脑损伤大鼠，比较研究后发现两者学习、记忆能力的改善无显著性差异，病理及双标免疫组化结果亦无显著性差异，提示两种移植途径具有同样促进缺氧缺血性脑损伤模型大鼠神经损伤恢复的作用，但从临床实际出发，尾静脉途径更具有临床应用价值。

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中文摘要

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前言

一、材 料 与 方 法

（一）实验材料

（二）实验方法

（三）统计方法

二、 实 验 结 果

（一）rMSCs的分离、扩增

（二）rMSCs的体外BrdU标记

（三）大鼠缺氧缺血性脑损伤模型制作及rMSCs移植后情况观察

（四）大鼠Morris水迷宫行为学检测

（六）脑组织病理切片和免疫组化结果

三、 分 析 和 讨 论

（一）中医对缺氧缺血性脑损伤疾病的认识

（二）MSCs的研究为小儿中枢神经系统疾病的治疗提供了新的思路

（三）有关实验方法的探讨

（四）缺氧缺血对脑组织的影响

（五）MSCs移植治疗缺氧缺血性脑损伤机制的探讨

（六）rMSCs不同移植途径的探讨

（七）黄芪注射液对MSCs修复缺氧缺血性脑损伤的可能机制

（八）中医药在MSCs修复中枢神经损伤中的应用

四、小 结

结论

参考文献

附图

致谢

附 文献综述:间质干细胞移植治疗缺血性脑损伤及其中药干预作用的研究