四物汤对溶血毒性血虚大鼠肝线粒体蛋白质组影响的研究

摘要

目的：应用蛋白质组学双向电泳和质谱技术，对正常对照组、乙酰苯肼溶血毒血虚组及四物汤治疗组大鼠肝线粒体蛋白质组进行分析，研究四物汤的分子生物学作用机理，探讨中医血虚证与能量代谢之间的关系。　　方法：18只大鼠随机分成三组：正常组、溶血毒性血虚组及四物汤治疗组。溶血毒性血虚组大鼠在第1,4,7天皮下注射2％乙酰苯肼生理盐水注射液，第1天10ml/kg体重，第4,7天剂量减半，第4天起生理盐水灌胃。治疗组大鼠按前溶血毒性血虚组造模，并于第4天起每天按生药8g/kg体重四物汤灌胃，共七天。正常对照组用等剂量生理盐水皮下注射、灌胃。实验第十一天眼眶取血，常规外周血检测，处死大鼠，骨髓涂片，取肝脏匀浆提取肝线粒体蛋白质。每组样品作3次重复双向电泳，共得到9张图谱，经过Image Master2D Platinum6.0软件分析后得到差异蛋白质。挖取感兴趣的差异蛋白质点，酶解后，质谱鉴定获得肽指纹图谱，所得结果与蛋白质组文库进行比对。确定蛋白质后，将其与肝脏线粒体蛋白质库比较，研究四物汤治疗血虚的分子生物学作用机理，探讨中医血虚证与能量代谢之间的关系。　　结果：与血虚组比较，四物汤治疗组大鼠外观状态迅速恢复，外周血中的红细胞数、网织红细胞百分比和血红蛋白量明显增加，白细胞数量明显下降。肿大的肝脏、脾脏明显缩小。经过Image Master2D Platinum6.0软件对9块胶检测得到的蛋白质点最多有986个，平均734个，其中所有图谱共有的匹配点560个，匹配率76.3%。选取所有胶上相互匹配且分辨清楚的蛋白质点进行统计学，筛选出具有明显差异（Varition>2.0，P<0.05）的蛋白质点45个。经过胶内酶切后用基质辅助激光电离质谱（MALDI TOF MS+MS/MS）进行检测，15个蛋白质点被确定。与正常对照组比较，乙酰苯肼致溶血毒血虚后，大鼠肝线粒体中热休克蛋白60(Hsp60)、3-巯基丙酮酸硫基转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase）、烯酰辅酶A水合酶（Enoyl-CoA hydratase）、电子转移黄素蛋白α亚单位（Electron transfer flavoprotein subunit alpha）的表达降低，抑制素(Prohibitin)、丙酮酸脱氢酶E1组分β亚单位（Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta）、二氢硫辛酸脱氢酶(Dihydrolipoyl dehydrogenase)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADH dehydrogenase)、ATP合成酶α亚单位(ATP synthasesubunit alpha)、ATP合成酶β亚单位(ATP synthasesubunitbeta)、三功能酶α亚单位(Trifunctional enzyme subunit alpha)、过氧化氢酶(Catalase)、延伸因子Tu(Elongation factorTu)、谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase，GLDH)、氨甲酰磷酸合酶(氨)(Carbamoyl-phosphate synthase[ammonia]，CPS-I)表达均升高。与溶血毒性血虚组比较，四物汤治疗后，ATP合成酶β亚单位、ATP合成酶α亚单位、Hsp60、氨甲酰磷酸合酶、3-巯基丙酮酸硫基转移酶、三功能酶α亚单位、烯酰辅酶A水合酶、电子转移黄素蛋白α亚单位表达量上调；抑制素、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶、二氢硫辛酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶E1组分β亚单位、过氧化氢酶、谷氨酸脱氢酶、延伸因子Tu表达量下调。　　结论：毒物乙酰苯肼诱导的血虚不仅表现血虚的一般状况和外周贫血血象改变；而且表现肝脏线粒体中多种分子表达异常和多方面的能量代谢障碍。四物汤可以明显促进骨髓造血，升高外周血中的红细胞数、血红蛋白量和网织红细胞数；可以调节线粒体内一些伴侣分子，稳定线粒体结构，保护线粒体功能；可以调整线粒体内多种与能量代谢相关蛋白质表达而改善能量代谢。从整体水平起了补益的作用。

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中文摘要

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前言

一、 材料与方法

（一）材料

（二) 实验方法

（三） 统计学方法

二、结果

1． 对大鼠一般情况的观察结果

2． 外周血象检测结果

3． 骨髓涂片瑞氏染色镜检结果

4． 提取的肝线粒体蛋白质浓度

5． 双向电泳银染图谱

6． 银染图谱分析结果

7． 质谱分析结果

三．分析与讨论

（一）中医学整体观及中医肝的藏象学理论

（二）肝脏线粒体蛋白质组学与整体观

（三）血虚证与四物汤治疗后分析鉴定的蛋白质与能量代谢相关

四 小结

结论

参考文献

附图

致谢

文献综述