基于转录组测序对鸡胚抗氧化酶活性的研究

摘要

鸡胚生长发育期间只能通过母鸡产蛋前在鸡蛋内沉积的营养物质来维持，且没有可以与外界进行代谢废物排出的器官，只能依靠自身来分解代谢产物，比如生长发育所产生的活性氧。胚胎在发育过程中，机体代谢速度加快，需要更多的氧来提供能量，同时会产生更多的活性氧，高水平的活性氧会造成蛋白质、脂质过氧化以及DNA损伤。此时存在于鸡胚中的第一道抗氧化防御线一超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)、过氧化物酶(POD)共同发挥作用来抵御活性氧。研究表明，生长发育过程中鸡胚不同组织中抗氧化酶活性是不断变化的，然而关于调控这些抗氧化酶活性变化的基因的鉴定及功能验证仍处于起步阶段。因此，本研究利用转录组测序技术筛选调控不同抗氧化酶活性的关键基因，从生物学角度阐明引起鸡胚发育过程中抗氧化酶活性变化的原因，并对筛选出来的关键基因进行功能验证。基于以上研究目的，本研究得到了以下3方面的试验结果:
　　1抗氧化活性鉴定:鉴定出鸡胚不同孵化期间，SOD活性高于GSH-PX和POD活性，其中以肝脏中活性最高，可以达到145.77±4.37U/mgprot。因此，以肝脏中的SOD活性作为筛选指标，采集孵化至第16d和第20d的肝脏组织用于后续的研究。
　　2转录组测序筛选关键基因:通过对孵化至16d和20d的鸡胚肝脏组织进行转录组测序，得到了57292698-65547680raw reads，过滤后得到了51868410-58937096clean reads，比对到参考基因组的reads均可达到79％以上。对样品间基因表达水平相关系数均大于0.97，设置阈值p＜0.05，foldchange≥1，筛选了1154个差异表达基因，GO富集分析得到了1069个显著富集的GO terms，从其中筛选出了10条和抗氧化酶活性相关的GO terms。GO富集和KEGG通路分析表明GSTA2，GSTA4，MGAT1，GPX3和HAO2参与了谷胱甘肽代谢以及活性氧的产生，因此确定为影响抗氧化酶活性的关键候选基因。
　　3关键基因的功能验证:分离培养鸡胚肝实质细胞，合成针对GPX3基因的小RNA干扰片段，转染细胞48h后收集细胞检测酶活。结果发现转染转染效率可以达到70％，3条小RNA片段对GPX3基因的表达都有一定的干扰效果，其中GPX3-gga-714片段对GPX3基因的干扰效率最明显，达到了55.27±0.06％。此外，从蛋白水平来看，小RNA片段干扰后对酶活性有一定的影响，干扰之后，细胞中SOD、CAT活性分别增加(12.85±0.01)U/mgprot，(1.19±0.38)U/mgprot，GSH-PX、POD活性分别降低了(0.52±0.44)U/mgprot、(0.89±0.85)U/mgprot。
　　本研究首次通过转录组测序技术对孵化期间鸡胚肝脏抗氧化酶体系进行了研究，鉴定出胚胎发育过程中调控抗氧化酶活性的关键基因及其调控机制，为进一步研究鸡胚生长发育提供理论依据，对于提高鸡肉制品及蛋制品的营养价值和经济效益具有重要意义。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1．2 第二代测序技术

1．1．3 第三代测序技术

1．2．1 转录组

1．2．2 转录组研究方法

1．3 RNA-Seq技术

1．3．1 预测新基因

1．3．2 基因表达水平研究

1．3．3 非编码区域功能研究

1．3．4 转录本结构变异

1．3．5 开发SNPs和SSR

1．4．1 活性氧来源

1．4．2 抗氧化成分研究进展

1．5 本课题研究目的及意义

第二章 鸡胚抗氧化酶活性测定

2．3 实验方法

2．3．1 受精蛋孵化

2．3．2 整个鸡胚蛋、鸡胚肝脏组织、鸡胚心脏组织制备

2．3．3 超氧化物歧化酶(SOD)测定

2．3．5 过氧化物酶测定

2．3．6 试验数据处理

2．4 结果与讨论

2．4．1 孵化期间鸡胚超氧化物歧化酶活力变化

2．4．2 孵化期间谷胱甘肽过氧化物酶活性变化

2．4．3 孵化期间过氧化物酶活性变化

2．4．4 讨论

2．5 本章结论

第三章 基于转录组测序技术研究鸡胚肝脏抗氧化酶活性

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 肝脏组织RNA提取

3．3．3 cDNA文库构建

3．3．4 聚类和测序

3．3．5 荧光定量PER

3．4 实验数据分析

3．4．1 原始测序数据

3．4．2 测序数据质量评估

3．4．3 参考序列比对

3．4．4 可变剪切分析

3．4．5 基因表达水平分析

3．4．6 差异表达分析

3．4．7 差异基因GO富集分析

3．5 实验结果与讨论

3．5．1 总RNA检测结果

3．5．2 转录组测序结果

3．5．3 参考序列比对结果

3．5．4 可变剪切分析

3．5．5 基因表达水平分析

3．5．6 差异基因表达分析

3．5．7 差异基因GO富集和KEGG通路分析

3．5．8 荧光定量PCR

3．5．9 讨论

3．6 本章结论

第四章 GPX3基因的功能验证

4．2．2 实验试剂

4．2．3 实验仪器

4．3．2 培养基包被

4．3．3 鸡胚肝实质细胞分离培养

4．3．5 SiRNA-FAM转染预实验

4．3．6 小RNA干扰片段转染鸡胚肝实质细胞

4．3．7 荧光定量PCR验证干扰效果

4．3．8 小RNA干扰片段对鸡胚肝细胞抗氧化酶活力的影响

4．3．9 数据处理

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 原代鸡胚肝细胞分离培养

4．4．2 转染预实验

4．4．3 GPX3最佳干扰片段筛选对鸡胚肝实质细胞转染效果

4．4．4 GPX3有效干扰片段筛选

4．4．5 小RNA干扰片段对鸡胚肝实质细胞抗氧化酶活性的影响

4．4．6 讨论

4．5 本章结论

第五章 结论与展望

5．2 展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况