海带多糖对阿霉素诱导的肾损伤干预作用

摘要

海带是一种盛产在低温海水中的大型海生褐藻类植物，呈扁平带状，最长可达到20m左右，因其多产及独特的口感已经被广泛用于烹饪食材。海带多糖也称昆布多糖，前人的研究表明海带多糖LJP61A能够通过减缓主动脉血管钙化从而干预肾衰竭的进程。本文主要以阿霉素诱导的肾损伤模型为出发点，探讨海带多糖LJP61A对小鼠急性肾损伤的干预效果，并在体外实验研究LJP61A对足细胞损伤形成的干预机制，现取得的研究结果如下:
　　(1)海带多糖LJP61A对阿霉素诱导的Balb/c小鼠肾损伤的干预研究:通过检测小鼠的体重、肾脏病理切片观察及血清各项生化指标，探究海带多糖是否干预了肾损伤疾病进程。组织切片病理学结果显示LJP61A对肾小球损伤和肾脏纤维化有一定的保护作用，且呈现量效关系。血清的生化检测结果显示LJP61A能降低总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)及尿素氮（BUN）、肌酐(Crea)水平，并且改善Ca2+、Mg2+、P3+等电解质及蛋白质的代谢紊乱状态，说明LJP61A能显著延缓阿霉素诱导的肾损伤疾病的发展进程。进一步利用HE、Masson、PAS染色显示LJP61A能够显著保护肾小球结构的稳定，减少炎性细胞浸润造成的损害，减缓肾小球足突融合，并通过Nephrin免疫组织化学分析，表明LJP61A能够稳定阿霉素对肾小球上皮细胞足突的毒性作用，保护肾小球过滤功能;qReal Time-PCR和Western blotting结果表明，LJP61A能显著降低炎性因子IL-1β、TNF-α的基因表达，抑制促炎蛋白MCP-1的蛋白表达，并且显著降低肾小球硬化信号通路相关蛋白TGF-β1/Smads的表达。以上结果显示LJP61A对阿霉素诱导的肾损伤有明显的干预作用。
　　(2)探究LJP61A对TGF-β1诱导的肾小球上皮细胞损伤的干预机制:采用TGF-β1诱导肾小球上皮细胞转分化模型，设置不同浓度组分观察LJP61A对肾小球上皮细胞生长状态影响，结果显示当LJP61A在浓度为5～25μg/mL时对细胞的生长有促进作用。细胞形态学观察LJP61A能够显著缓解肾小球上皮细胞足突的损伤，维持细胞功能的完整。通过Western blotting结果找出16h时为TGF-β1诱导Nephrin表达最低点，qRT-PCR结果表明，LJP61A通过Smad3/p38途径调节Nephrin及抑制纤维化蛋白α-SMA的表达从而阻断肾小球上皮细胞转分化为间充质细胞。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1．1 急性肾损伤的研究进展

1．1．2 肾小球损伤的研究进展

1．2 海带多糖LJP61A的研究进展

1．3．1 研究主要内容

1．3．2 研究技术路线如下图

第二章 LJP61A在阿霉素诱导的小鼠肾损伤中的作用

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 实验材料及动物

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 海带多糖的提取

2．3．2 海带多糖的分离纯化

2．3．3 小鼠肾损伤模型的构建及生命体征的检测

2．3．4 肾脏组织切片观察

2．3．5 小鼠血清相关生理生化及电解质的检测

2．3．6 尿液相关生化指标的检测

2．3．7 定量RT-PCR检测肾脏组织中炎性因子、肾损伤标志蛋白WT-1和纤维化标志物α-SMA的表达

2．4 结果与分析

2．4．1 LJP61A的均一成分检测

2．4．2 小鼠体重变化

2．4．3 LJP61A对小鼠尿液量与饮水量水平的变化的影响

2．4．4 各剂量LJP61A对小鼠血清生化指标的影响

2．4．5 各剂量LJP61A对小鼠血清电解质指标的影响

2．4．6 肾脏组织形态观察

2．4．7 各剂量LJP61A对小鼠脏器的影响

2．4．8 组织HE染色

2．4．9 PAS染色

2．4．10 Real-time PCR检测

2．5 讨论

2．6 结论

第三章 LJP61A对TGF-β1介导的信号通路的调控作用

3．1 引言

3．2 实验方法

3．2．1 Masson染色

3．2．2 Nephrin免疫组化

3．2．3 Western blot分析

3．2．4 Real-time PCR检测TGF-β1／smad3信号通路表达情况

3．3 结果与分析

3．3．1 Masson染色

3．3．2 Nephrin免疫组化

3．3．3 Western-Blot结果

3．3．4 Real-time PCR检测

3．4 讨论

3．5 结论

第四章 LJP61A对TGF-β1诱导的足细胞转分化的调控作用

4．1 引言

4．2 实验方法

4．2．1 足细胞系培养

4．2．2 MTT法观察LJP61A对足细胞生长状态的影响

4．2．3 细胞形态学观察

4．2．4 Real-Time PCR观察足细胞结构标志分子表达变化

4．2．5 Western-Blot方法分析TGF-β1诱导后足细胞足突标志分子Nephrin不同时间点的表达情况

4．2．6 数据收集与统计分析

4．3 实验结果

4．3．1 细胞形态学观察

4．3．2 MTT法观察LJP61A对足细胞生长状态的影响

4．3．3 Western-Blot方法分析TGF-β1诱导后足细胞足突标志分子Nephrin不同时间点的表达情况

4．3．4 Real-Time PCR观察足细胞结构标志分子表达变化

4．3．5 LJP61A对TGF-β1诱导的Smad3和p38通路活化的影响

4．3．7 Smad3抑制剂和p38抑制剂存在时LJP61A对α-SMA和Nephrin mRNA的影响

4．4 讨论

4．5 结论

参考文献

攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况