小基因组技术在恩拉霉素生产菌种改造中的应用

目录

声明

摘要

1．1．1链霉菌的概述

1．1．2链霉菌因组特点

1．2恩拉霉素

1．2．1恩拉霉素的理化特性

1．2．2恩拉霉素的生物合成

1．2．3恩拉霉素的应用及生产情况

1．3非核糖体多肽酶

1．3．1非核糖体肽合成酶的结构及作用机理

1．3．2底物特异性

1．3．3非核糖体多肽合成酶的应用

1．4聚酮合酶

1．4．1 Ⅰ型PKS

1．4．3Ⅲ型PKS

1．5小基因组技术

1．6链霉菌的无痕敲除

1．6．1链霉菌的无痕敲除进展

1．6．2反向筛选标记基因的介绍

1．7研究目的和研究内容

1．7．1研究目的

1．7．2研究内容

2材料与方法

2．1．1菌株

2．1．2质粒及特点

2．1．3引物

2．1．4实验试剂

2．1．5实验设备与仪器

2．1．6相关溶液配制

2．1．7培养基

2．2实验方法

2．2．1菌种培养及保藏

2．2．2 5-氟尿嘧啶对Streptomyces fungicidicus最低抑菌浓度的考察

2．2．3 PCR扩增基因片段

2．2．4细菌DNA的小量提取

2．2．5大肠杆菌感受态细胞的制备

2．2．6 E．coli JM109感受态细胞的转化

2．2．7大肠杆菌与链霉菌属间接合转移

2．2．8链霉菌的发酵培养

2．2．9以枯草芽孢杆菌为指示菌对产恩拉霉素产量的检测

2．2．10放线菌染色

3结果与讨论

3．1 upp基因为反向筛选标记基因无痕敲除系统的建立

3．1．1 5-氟尿嘧啶对Streptomyces fungicidicus最低抑菌浓度的考察

3．1．2 upp基因敲除打靶载体的构建

3．1．3大肠杆菌ET12567介导Streptomyces fungicidicus的接合转移

3．1．4 upp基因缺失菌株的筛选

3．1．5 upp基因缺失对菌株生长及发酵能力的影响

3．1．6 upp基因的回补

3．2杀真菌链霉菌全基因组测序结果与分析

3．3 nrps基因的敲除

3．3．1 nrps敲除质粒的构建

3．3．2 nrps基因敲除菌的筛选

3．3．3单个nrps生物合成基因簇的敲除对于恩拉素产量的影响

3．3．4 nrps基因的连续敲除

3．3．5连续敲除两个nrps生物合成基因簇对恩拉霉素产量的影响

3．4pks基因的敲除

3．4．1 pks基因敲除载体的构建

3．4．2基因敲除菌株的获得

3．4．3基因敲除菌株的发酵及活性检测

4结论

4．1全文总结

4．2论文的创新点

4．3论文的不足之处

5展望

参考文献

7攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢