高产酸性脲酶菌株的筛选及该酶在黄酒中的应用

摘要

氨基甲酸乙酯(EC)作为一种潜在致癌物，广泛的存在于发酵食品和酒精饮料中。在各种发酵酒中，黄酒面临的EC超标问题更为突出。国内外众多学者针对酒精饮料中EC含量超标的问题提出了很多解决策略，其中，利用酸性脲酶消除其前体物质尿素被认为是最为有效的一种方法。
　　本论文研究的内容包括高产酸性脲酶菌株的筛选和鉴定、菌株发酵产酶条件的优化、酶的分离纯化、酶学性质的研究以及酶在黄酒中的应用效果初探。主要研究结果如下:
　　(1)以小鼠粪便、合肥豆制品厂和乳制品厂的污泥为来源，通过初筛和复筛筛选到一株产酸性脲酶能力较高的菌株，酶活为1.12U/mL，根据菌株的形态特征、部分生理生化实验鉴定以及16S rDNA序列分析，确定该菌株为Staphylococcus cohnii命名为Staphylococcus cohnii HFUTY-08。
　　(2)通过单因素实验和正交试验对菌株的发酵产酶条件和提酶条件进行优化，得到的最佳发酵培养基成分为:葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，牛肉膏0.5％，KH2PO40.2％，NaCl0.5％，NaAc0.2％，尿素0.5％，四水硫酸锰0.005％，六水硫酸镍0.005％，初始pH5;最佳培养条件为:接种量5％，培养时间26h，培养温度32℃，转速为200r/min;最佳提酶条件为:超声功率400W，超声时间20min（开2S，停4S），优化后的酸性脲酶活力达到1.98U/mL，提高了1.8倍。
　　(3)粗酶液通过乙醇分级沉淀、超滤、DEAE-52离子交换层析、葡聚糖凝胶G-200凝胶过滤层析等方法进行分离纯化，得到了一定纯度的酶。全酶分子量约为295Kda，SDS-PAGE显示出该酶由三个亚基α(65kDa)，β(18kDa)，γ(14.5kDa)组成，组成形式为(αβγ)3。然后对其酶学性质进行研究，结果表明:该酶最适反应温度为35℃，温度稳定范围为25～45℃，最适反应pH为4.5，pH值稳定范围为4～6，酶在4℃下保存60天仍具有80％以上的酶活;酶的Km值为13.6mmol/L，Vmax为1.68μmol/L/min;该酶还具有较好的耐乙醇性，在5％～20％的乙醇范围内能够保持80％以上的酶活。
　　(4)最后，初步研究了酸性脲酶在黄酒中对尿素的去除效果，结果显示:该酶在37℃，72h内能够去除75％左右的尿素;并且，通过酶的处理，可以使黄酒在煎酒过程中生成的EC含量降低75.7％，表明该酶在黄酒中具有潜在的应用价值。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 黄酒概述

1．1．1 黄酒营养价值及发展现状

1．1．2 黄酒面临的食品安全问题

1．2 氨基甲酸乙酯概述

1．2．1 氨基甲酸乙酯的性质与致癌性

1．2．2 发酵酒和食品中的EC问题

1．2．3 饮料酒精中EC的形成途径

1．3 酸性脲酶概述

1．3．1 国内外研究进展

1．4．1 关键技术问题

1．4．2 研究目的

1．4．3 立题意义

1．4．4 研究内容

第二章 高产酸性脲酶菌株的筛选

2．1 材料与仪器

2．1．1 样品来源

2．1．2 培养基配制(g／100mL)

2．1．3 主要试剂

2．1．4 实验仪器与设备

2．2 实验内容及方法

2．2．1 脲酶活力测定

2．2．2 产酶菌株的筛选

2．2．3 粗酶液的提取

2．2．4 菌株的形态特征观察及生理生化鉴定

2．2．5 菌株的基因测序及分子生物学鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 菌株筛选结果

2．3．2 菌株HFUTY-08的鉴定结果

2．4 小结

第三章 菌株发酵产酶条件及提酶条件的优化

3．1 材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 实验仪器与设备

3．2 实验内容及方法

3．2．1 菌株发酵培养条件的优化

3．2．2 酶的提取条件优化

3．3 结果与分析

3．3．1 菌株生长曲线测定

3．3．2 碳源对产酶能力的影响

3．3．3 氮源对产酶能力的影响

3．3．4 起始pH对产酶能力的影响

3．3．5 接种量对产酶能力的影响

3．3．6 培养温度对产酶能力的影响

3．3．7 摇床转速对产酶能力的影响

3．3．8 正交试验

3．3．9 超声功率对提酶能力的影响

3．3．10 超声时间对提酶能力的影响

3．4 小结

第四章 酸性脲酶的分离纯化及酶学性质的研究

4．1 材料与仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 实验仪器与设备

4．2 实验内容及方法

4．2．1 酶液中蛋白质含量的测定

4．2．2 黄酒中尿素去除率的测定

4．2．3 酶的分离纯化

4．2．4 酸性脲酶的酶学性质研究

4．2．5 酶在黄酒中的应用效果初探

4．3 结果与分析

4．3．1 乙醇分级沉淀

4．3．2 DEAE-52阴离子交换层析

4．3．3 Superdex G-200凝胶过滤层析

4．3．4 酸性脲酶纯化结果及SDS-PAGE电泳鉴定

4．3．5 全酶分子量的测定

4．3．6 酶的反应动力学常数测定

4．3．7 酶的最适温度

4．3．8 酶的最适pH

4．3．9 酶的温度稳定性

4．3．10 酶的pH稳定性

4．3．11 酶的乙醇耐受性

4．3．12 酶的贮藏稳定性

4．3．13 酶在黄酒中对尿素的去除率

4．3．14 应用酶前后对黄酒中EC含量的影响

4．4 小结

第五章 结论及展望

5．1 主要结论

5．2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况