GRP78在大鼠胆道梗阻及再通术后肝脏组织中表达变化和中药的干预作用研究及临床观察

摘要

目的：　　本研究通过建立SD大鼠梗阻性黄疸模型及梗阻再通模型，观察梗阻性黄疸时GRP78在大鼠肝组织中的表达变化及其意义；探讨梗阻性黄疸再通术后GRP78表达变化及中药茵陈蒿汤对肝脏的保护作用，以及茵陈蒿汤用于因胆管结石导致梗阻性黄疸术后的临床疗效观察。　　方法：　　1、动物实验　　选择成年雄性SD大鼠128只，体重(270-300)g，动物级别为清洁级，将大鼠随机分为四组：（1）假手术对照组(S组)32只；（2）梗阻性黄疸组(O组)32只；（3）梗阻性黄疸再通模型+生理盐水灌胃组(OM组)32只；（4）梗阻性黄疸再通模型+中药灌胃组(ON组)32只。S组与O组于术后1、3、5、7D,每时相点处死大鼠8只，OM组与ON组均于梗阻7天后解除梗阻,并于解除梗阻后1、3、5、7D每个时相点处死大鼠8只。留取血液标本及肝脏组织，检测血清中TBIL、ALT、AST等生化指标含量；另取肝组织固定于5％中性福尔马林溶液，石蜡包埋，5μm切片行HE染色观察肝组织的病理改变，并免疫组化检测肝组织GRP78的表达；剩余肝组织经液氮速冻后置于-80℃冰箱，用western blot测肝组织中GRP78蛋白表达变化；用Real-Time PCR检测大鼠肝组织GRP78基因表达量情况。　　2、临床研究　　选择符合诊断标准的梗阻性黄疸患者60例，随机分为常规西医治疗对照组(简称对照组)30例，常规西医治疗基础上加服茵陈蒿汤治疗组(简称治疗组)30例。对照组为常规纯西医治疗，治疗组采取西医常规处理的基础上给予茵陈蒿汤，其中茵陈蒿汤送我院中药房煎煮，每次服用100ml，每日2次温服，服用5天。观察两组血清总胆红素，谷丙转氨酶、谷草转氨酶变化情况。　　结果：　　1、动物实验　　1.1 血清生化指标的变化　　S组术后第1天ALT、AST有轻度升高，但是都处于正常值范围，差异无统计学意义；与S组比较，O组术后第1天就出现ALT、AST迅速增高；其中ALT、AST均于术后第1天达到峰值，然后开始下降，自第3天起维持在较高水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。OM组及ON组解除梗阻后AST均呈下降趋势，与OM组比较，ON组在给完中药后第3、5天数值均低于OM组，下降趋势表现更加明显(P<0.05)，直至两组均恢复大致正常水平；ON组的ALT水平在第1、3天数值均低于OM组，下降趋势也更加明显(P<0.05)，直至两组恢复大致正常水平。S组术后TBIL、DBIL均无明显变化，差异无统计学意义；与S组比较，O组梗阻后TBIL、DBIL均呈增高趋势，并于第5、7天后趋于稳定(P<0.05)。OM组及ON组再通后TBIL、DBIL均显著下降，ON组各个时相点均低于OM组，下降趋势更明显(P<0.05)。　　1.2 肝组织病理学改变　　S组肝细胞无肿胀、坏死，肝细胞索排列整齐，未见炎性细胞浸润，显示正常肝小叶结构；O组胆管结扎后第1天可见汇管区、肝血窦内有淤胆现象，少量炎性细胞胞浸润，第3天可见细小胆管和无管腔的小胆管增生，第7天可见少量肝细胞的坏死灶。OM组及ON组在解除梗阻后3天开始，随着时间的延长，肝组织内炎性细胞浸润逐渐减少，纤维组织细胞增生明显减轻，肝细胞变性坏死灶减少。ON组肝细胞在解除梗阻病理学改变优于OM组。　　1.3 Real-Time PCR检测大鼠肝组织GRP78mRNA基因表达量情况　　S组GRP78mRNA表达水平随造模时间加长无明显变化，一直处于低位水平，差异无统计学意义。O组GRP78mRNA表达水平随造模时间加长升高，5天时达到最高点，随后下降，与S组比较，O组GRP78mRNA表达水平在各个时相点均高于S组，差异有统计学意义（P<0.05）。OM组及ON组解除梗阻后GRP78mRNA的表达水平均有下降，7天时达到最低点；以OM组为对照组，ON组GRP78mRNA的表达水平在各时相点均表现明显差异(P<0.05)，ON组GRP78mRNA表达水高于OM组。　　1.4 免疫组化检测肝组织GRP78的表达　　镜下可见S组大鼠肝脏内表达较少的GRP78。随着造模时间的延长，O组GRP78阳性表达量逐渐增加，5天时达到最高点，随后下降，主要表达于肝细胞胞浆内，与S组比较P<0.05。OM组及ON组解除梗阻后GRP78蛋白的表达量均有下降，7天时达到最低点；与OM组相比，ON组GRP78的表达量各时相点均高于OM组(P<0.05)。　　1.5 采用western blot检测肝组织中GRP78表达变化　　在蛋白表达水平上，以GAPDH为内参，S组术后GRP78表达不明显，且差异无统计学意义了；以S组为对照组，O组GRP78的表达量升高，5天时达到最高点，随后下降，各时相点均出现明显差异(P<0.05)。OM组及ON组解除梗阻后GRP78蛋白的表达量均有下降，7天时达到最低点；以OM组为对照组，ON组GRP78的表达量与之比较，各时相点均出现明显差异(P<0.05)，ON组GRP78表达水平高于OM组。　　2、临床研究　　在研究中，测定30例治疗组和30例对照组患者手术前后血清TBIL，ALT及AST。术后两组梗阻性黄疸患者血清TBIL、ALT及AST同术前相比均有所下降，低于术前1 d测定值，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组梗阻性黄疸患者术后血清TBIL， ALT及AST均低于对照组同期观察值，组间差异有统计学意义(P<0.05)。　　结论：　　1、梗阻性黄疸形成初期因启动了非折叠蛋白反应，GRP78及GRP78mRNA表达上调，但随着梗阻时间延长，使内质网出现功能障碍，保护机制失代偿，GRP78及GRP78mRNA表达下降，肝细胞凋亡增加，这表明在梗阻性黄疸大鼠模型中，存在GRP78介导的ERS。　　2、梗阻性黄疸大鼠模型解除梗阻后给予中药茵陈蒿汤可以使GRP78mRNA的表达上调，可能发挥了GRP78抵抗细胞凋亡作用保护机制，改善肝脏因梗阻引起的肝功能异常。表明梗阻性黄疸大鼠模型解除梗阻后给予中药茵陈蒿汤可以调节GRP78 mRNA的表达。　　3、茵陈蒿汤对胆管结石术后黄疸的消退和肝脏功能的恢复起到了一定的促进作用。同时由于肝脏功能的及早恢复对病人营养状态及免疫功能的调节等方面也起到了间接促进作用。中西医结合治疗方案有望成为目前治疗的一种新的补充。

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综述：内质网应激在梗阻性黄疸肝细胞凋亡中的作用及中药的干预机制

前言

1 研究现状、成果

2 研究目的、方法

第一部分梗阻性黄疸大鼠肝脏中GRP78表达

1 实验对象与实验方法

2 实验结果及分析

3 讨论

4 小结

第二部分茵陈蒿汤对胆道梗阻再通后肝组织GRP78表达及肝功能影响

1 实验对象与方法

2 实验结果及分析

3 讨论

4 小结

第三部分临床研究

1 一般资料

2 研究方法

3 观察结果

4 讨论

5 小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表论文情况