Tet1和Tet2对小鼠胚胎干细胞端粒维持的作用

摘要

胚胎干细胞之所以可以维持其自身的多能性和自我更新能力，是由于其特定的基因表达模式和表观遗传修饰。端粒长度的维持对于胚胎干细胞的无限自我更新和多能性是至关重要的，而且其长度受很多表观遗传变化的影响，例如:DNA甲基化，组蛋白修饰等。Tet家族是最近几年发现的一种DNA羟甲基化酶。Tet1和Tet2是Tet家族的两个成员，在胚胎干细胞中高表达。DNA甲基化的直接变化主要依赖DNA甲基转移酶和DNA羟甲基酶。　　 本文研究了DNA去甲基化对于胚胎干细胞端粒的维持和多能性的影响，通过RNA干扰技术在胚胎干细胞中对Tet1和Tet2的表达进行干扰。我们发现，单独降低Tet1或是Tet2对胚胎干细胞的多能性没有影响，但是当这两个基因均敲低时多能基因表达下降，但仍可以维持一定水平，体外分化研究也证明Tet1和Tet2均敲低的细胞系向外胚层和中胚层分化能力下降，但似乎有利于向内胚层分化。同时我们发现Tet1和Tet2干扰之后端粒长度变短了，而且有端粒丢失和染色体融合现象发生。端粒功能紊乱似乎与细胞中组蛋白抑制性标志H3K9me3和H3K27me3整体水平上调有关。综上，Tet1和Tet2在胚胎干细胞中端粒长度维持和保持多能性上发挥重要作用，而Tet1或Tet2在其中一个功能抑制时另一个起互补作用。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 胚胎干细胞的研究现状

1．1．1 胚胎干细胞的建立

1．1．2．胚胎干细胞的研究意义和现状

第二节 胚胎干细胞的表观遗传与端粒

1．2．1．胚胎干细胞的表观遗传研究

1．2．2．表观遗传与端粒

1．2．3．端粒与人类健康

第三节 Tet1和Tet2的研究现状

1．3．1 Tet1和Tet2与胚胎干细胞

1．3．2 Tet1和Tet2与表观遗传

第二章 Tet1和Tet2在小鼠各类型细胞中的表达情况

第一节 导言

第二节 实验材料和方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 仪器与试剂耗材

2．2．3 实验方法

第三节 实验结果

2．3．1 不同类型细胞形态图

2．3．2 Tet1和Tet2在多能细胞和分化细胞中的表达比较

2．3．3 实时定量PCR测定不同组织中Tet1和Tet2的表达情况

第四节 讨论

第三章 两种不同背景的胚胎干细胞中Tet1和Tet2稳定敲低细胞系的建立和鉴定

第一节 导言

第二节 材料与方法

3．2．1 材料

3．2．2 仪器与试剂耗材

3．2．3 实验方法

第三节 实验结果

3．3．1 Tet1和Tet2干扰载体的构建

3．3．2 J1瞬时转染筛选有效干扰序列

3．3．3 在NF2和BF10两个细胞系中建立稳定的干扰细胞系

3．3．4 Tet1和Tet2敲低后对ES细胞多能性和分化能力的影响

第四节 讨论

第四章 在NF2和BF10两个细胞系中敲低Tet1和Tet2对胚胎干细胞的影响

第一节 导言

第二节 实验方法

第三节 实验结果

4．3．1 Tet1和Tet2敲低后对ES细胞端粒的影响

4．3．2 Tet1和Tet2敲低后对端粒酶基因和重组蛋白表达水平的影响

4．3．3 Tet1和Tet2敲低后对ES细胞DNA甲基化的影响

4．3．4 Tet1和Tet2敲低后对Es细胞组蛋白甲基化的影响

第四节 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

附录A 缩写词

个人简历及攻读学位期间发表的论文和研究成果