硫化氢调控葡萄贮藏保鲜的作用及其机制的研究

摘要

葡萄因其营养丰富味美多汁而深受消费者喜爱，保持采后葡萄的营养品质和商品品质具有重要意义。硫化氢作为一种新型气体信号分子参与植物体内的多种生理生化过程已被证实。但硫化氢在采后葡萄保鲜中的作用及其机理的研究尚未有报道。本论文以采后葡萄为材料，以外源硫氢化钠为供体处理采后葡萄果实，明确H2S处理采后葡萄生理生化、转录水平、代谢水平的变化，进一步采用转录组-代谢组联合分析的方法明确H2S处理调控采后葡萄白藜芦醇和花青素合成的机制。论文的研究对于把硫化氢开发为开发葡萄的保鲜剂提供了理论依据，为明确硫化氢调控植物的抗衰老机理及次生代谢产物的合成等信号转导机制提供理论依据。
　　主要结果主要如下:
　　(1)H2S处理采后葡萄生理生化变化。采用H2S供体NaHS溶液处理葡萄果实，发现外源硫化氢的应用的最佳浓度为1.0mmol L-1。H2S可以降低果梗的褐变指数并降低果实的腐烂率和失重率，同时延缓葡萄果实硬度的下降;H2S可以不同程度的减缓果实中可溶性固形物、还原糖、可溶性蛋白质、可滴定酸含量的下降;延缓葡萄果实及果梗中叶绿素的分解的同时保持类胡萝卜素含量的稳定，在表观上保持了葡萄果梗的鲜绿，防止了果实的黄化;H2S还可以延缓采后葡萄中Vc及总酚的下降，使其保持在稳定水平。H2S可降低H2O2、·O2-等活性氧产物及膜脂过氧化产物MDA在葡萄果实和果梗中的积累，增强POD、CAT、APX等活性氧清除酶系活性的同时下调LOX和PPO的活性。上述说明硫化氢通过动员这些贮藏物质的代谢活动可以增强果实的抗衰老能力，发挥其抗氧化作用，从而延缓采后葡萄果实的衰老;H2S信号分子参与了植物细胞内一系列与氧化代谢有关的生理生化过程，通过抑制活性氧产物的累积，提高抗氧化酶系统的活性，最终表现为延缓了采后葡萄的衰老。
　　(2)H2S处理采后葡萄转录水平的变化。采用表达谱转录组测序的方法，明确硫化氢处理后葡萄差异表达的基因随时间而不同。第2、4、6天的葡萄差异表达基因总体为1038个，处理后第2、4、4天的葡萄差异表达基因分别为2445、2020和2345个。处理后2、4和6天总体差异变化基因对花青素合成通路、黄酮和黄酮醇生物合成和牛磺酸与牛磺酸代谢通路影响最大。处理的天数不同，影响最大的通路存在差别。处理后2天时差异变化基因对光合触发蛋白、牛磺酸与亚牛磺酸代谢和黄酮和黄酮醇生物合成通路影响最大;处理后4天时差异变化基因对亚油酸代谢、黄酮和黄酮醇生物合成、牛磺酸与亚牛磺酸代谢通路影响最大;处理后6天时差异变化基因对花青素合成、牛磺酸与亚牛磺酸代谢、黄酮和黄酮醇生物合成通路影响最大。上述结果说明硫化氢可以调控采后葡萄的细胞中各种复杂生理代谢过程、次生代谢产物合成、不同激素的调控作用、光合作用和病原菌的互作等方面，从基因水平揭示了硫化氢调控采后葡萄的抗衰老抗氧化的机理。
　　(3)H2S处理采后葡萄代谢水平的变化。采取液质联用的方法，调查H2S处理采后不同天数的葡萄整个代谢物的变化情况。H2S处理后葡萄的代谢谱发生了明显变化。硫化氢处理后阳离子模式下共有的差异代谢物有300个，阴离子模式下共有的差异代谢物有304个。通过KEGG通路富集后，正离子模式下筛选出19个、负离子模式下筛选到34个差异代谢物可以作为H2S处理后葡萄代谢变化的标志物。差异代谢物富集的通路随H2S处理的时间而变化。整体水平看，H2S处理后，阳离子模式下影响最大的5个代谢通路为二苯酚，二甲苯和姜二醇生物合成通路、萘降解、芳香化合物的降解、代谢途径、次生代谢产物合成途径;阴离子模式下影响最大的5个代谢通路为苯丙氨酸代谢、甲苯降解、苯甲酸降解、2-羰基羧酸代谢、二苯酚，二甲苯和姜二醇生物合成通路。
　　(4)H2S处理调控采后葡萄白藜芦醇和花青素合成的机制。硫化氢处理后，葡萄的类黄酮、白藜芦醇和花青素的含量显著上升。硫化氢处理后，葡萄的白藜芦醇合成中的16个关键基因均有不同程度的表达变化，而苯基丙氨酸、苯丙氨酸、P-香豆酸和白藜芦醇等代谢物显著增加。硫化氢处理后，葡萄的花青素合成途径中10个关键基因均有不同程度的表达变化，相应的二氢山奈酚、柚皮苷、白天竺葵甙元、矢车菊素3-O-3'，6'-O-二甲酰葡萄糖苷也出现了显著的提高。
　　以上研究结果从表观水平、理化性质、基因水平及代谢水平系统的揭示了采后葡萄对硫化氢的响应机制，为解释硫化氢处理采后果实如何影响细胞内化合物的代谢提供了数据基础，从而为探究硫化氢延缓采后果实的衰老机制提供理论依据。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 前言

1．1 研究背景

1．2 果实采后保鲜的生理机制

1．3 葡萄常见的保鲜方式及研究进展

1．3．1 二氧化碳气调保鲜

1．3．2 二氧化硫保鲜

1．3．3 二氧化氯保鲜

1．3．5 壳聚糖涂膜保鲜

1．3．6 臭氧保鲜

1．3．7 辐射保鲜

1．4．1 硫化氢的性质及简介

1．4．2 硫化氢在植物体内合成

1．4．3 硫化氢在植物体的功能

1．5．1 代谢组概念

1．5．2 代谢组学研究技术及发展进展

1．6．1 转录组概念

1．6．2 转录组研究技术及发展进展

1．7 白藜芦醇及其糖苷的研究现状

1．7．1 自藜芦醇在葡萄中存在状况及功能

1．7．2 白藜芦醇对人体的活性功能

1．7．3 白藜芦醇及其糖苷检测方法的研究

1．8 花青素研究现状

1．8．1 花青素结构及合成途径

1．8．2 花青素生物功能

1．9．1 研究目的与意义

1．9．2 研究技术路线

1．9．3 研究内容

第二章 硫化氢对采后葡萄贮藏期生理生化性质的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 主要试剂与设备

2．1．2 材料及其处理

2．1．3 葡萄贮藏期的表观评定方法

2．1．4 果梗褐变指数及果实失重率、硬度的测定

2．1．5 可溶性固形物、还原糖、可滴定酸及可溶性蛋白质测定

2．1．6 叶绿素、类胡萝卜素的测定

2．1．7 抗坏血酸、总酚的测定

2．1．8 MDA、H2O2和·O2-含量的测定

2．1．9 POD、APX、CAT的活性测定

2．1．10 LOX和PPO的活性测定

2．1．11 统计分析方法

2．2 结果与分析

2．2．1 硫化氢对采后葡萄贮藏期表观的影响

2．2．2 硫化氢对采后葡萄品质指标影响

2．2．3 硫化氢对采后葡萄理化指标的影响

2．2．4 硫化氢对采后葡萄叶绿素、类胡萝卜素的影响

2．2．5 硫化氢对采后葡萄抗氧化物质含量的影响

2．2．6 硫化氢对采后葡萄衰老过程中MDA、H2O2和·O2-含量的影响

2．2．7 硫化氢对采后葡萄衰老过程中POD、CAT和APX活性的影响

2．2．8 硫化氢对采后葡萄衰老过程中LOX、PPO活性的影响

2．3 结论

第三章 硫化氢处理对采后葡萄的转录水平的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器与设备

3．1．3 方法

3．1．4 转录组表达谱分析

3．1．5 生物信息学分析

3．1．6 定量PCR

3．2 结果与分析

3．2．1 测序数据及其质量控制

3．2．2 转录组数据与参考基因组序列比对效率比对

3．2．3 基因表达量整体分析

3．2．4 差异表达基因分析及筛选

3．2．5 差异表达基因功能注释和富集分析

3．2．6 差异表达基因KEGG注释

3．2．7 差异表达基因KEGG代谢通路富集分析

3．2．8 显著影响的通路的差异表达基因验证

3．2．9 其他显著差异表达基因验证

3．3 结论

第四章 硫化氢处理对采后葡萄代谢水平的影响

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要仪器与设备

4．1．3 材料及样品信息

4．1．4 样本预处理及代谢物提取

4．1．5 代谢组分析方法

4．1．6 HPLC-MS色谱条件

4．1．7 信息分析流程

4．2 结果与分析

4．2．1 质控分析

4．2．2 PCA主成分分析

4．2．3 偏最小二乘判别分析

4．2．4 单变量分析

4．2．5 差异性代谢物的筛选

4．2．6 差异性代谢物的代谢通路富集分析

4．3 结论

第五章 硫化氢对葡萄的白藜芦醇和花青素合成通路的调控

5．1．1 主要试剂

5．1．2 主要仪器与设备

5．1．3 材料

5．1．4 类黄酮测定

5．1．5 白藜芦醇的提取

5．1．6 白藜芦醇的纯化

5．1．7 白藜芦醇标准曲线测定

5．1．8 葡萄样品中白藜芦醇HPLC测定

5．1．9 花青素分析测定方法

5．1．10 转录组和代谢组分析实验材料与方法

5．1．11 定量PCR方法

5．2 结果与分析

5．2．1 类黄酮含量分析

5．2．2 白藜芦醇含量分析

5．2．3 花青素含量分析

5．2．4 白藜芦醇转录-代谢联合通路分析

5．2．5 白藜芦醇合成途径重要差异表达基因验证

5．2．6 硫化氢处理对葡萄白藜芦醇合成途径的调控机制

5．2．7 花青素转录-代谢联合通路分析

5．2．8 花青素合成途径重要差异表达基因验证

5．2．9 硫化氢处理对葡萄花青素合成途径的调控机制

5．3 结论

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 本文创新点

6．3 展望

参考文献

攻读博士学位期间的学术活动及成果情况