提高盾叶薯蓣内生真菌Dzfl2中螺二萘类化合物palmarumycins C12和C13产量的策略

摘要

药用植物内生真菌是新型天然活性物质的重要来源，其在农业、医药以及食品工业等领域具有潜在的应用前景。利用内生真菌发酵来实现活性物质的工业化生产，可以提高其产量，同时对减少野生药用植物多样性的破坏具有重要意义。螺二萘化合物是一类具有抗菌、抗癌、抗细胞毒和抗寄生虫等活性的萘醌类衍生物。前期研究发现，盾叶薯蓣内生真菌Dzf12是一株螺二萘类化合物的高产菌株，具有良好的研究价值。本文以盾叶薯蓣内生真菌Dzf12为研究对象，分别制备了其宿主植物的多糖和寡糖，研究了多糖和寡糖对内生真菌Dzf12菌丝生长和螺二萘类化合物palmarumycins C12和C13产量的影响，评价了多糖的抗氧化活性，优化了水提多糖的提取制备工艺，同时探讨了表面活性剂和氧载体对内生真菌Dzf12菌丝生长和螺二萘类化合物palmarumycins C12和C13产量的影响。通过实验研究，以期为宿主植物与内生真菌之间相互关系的研究提供依据，为Dzf12菌株中活性产物palmarumycins C12和C13的大规模工业化生产打下基础，为盾叶薯蓣抗氧化活性多糖和寡糖的开发利用奠定基础。　　本研究获得的主要结果如下：　　1、通过制备盾叶薯蓣水提多糖( WEP)、碱提多糖(SEP)和酸提多糖(AEP)分别与内生真菌Dzf12发酵共培养，发现WEP对内生真菌Dzf12的菌丝生物量和螺二萘类化合物palmarumycins C12和C13产量具有显著的促进作用。当添加400 mg/L的WEP到培养了3d的培养液中，培养15 d后可使palmarumycins C12和C13的产量分别达67.73和350.76 mg/L，分别是对照的8.76和2.69倍。　　2、研究了寡糖对内生真菌Dzf12菌丝生长及次生代谢产物的影响。通过制备水提多糖(WEP)、碱提多糖(SEP)和酸提多糖(AEP)相应的寡糖（OW，OS和OA）与内生真菌Dzf12共培养。在三种寡糖中，发现OW对内生真菌Dzf12的菌丝生物量和螺二萘类化合物palmarumycins C12和C13产量的促进作用最显著。当在第3d添加300 mg/L的OW到Dzf12培养液中，培养15 d后可使palmarumycins C12和C13的产量分别达87.96和422.28 mg/L，分别是对照的9.83和3.24倍。　　3、对WEP、SEP和AEP的体外抗氧化活性进行了评价。发现盾叶薯蓣水提多糖WEP在DPPH自由基清除模型、Fe3+还原模型、Fe2+螯合模型和·OH自由基清除模型均表现出较好的活性，其EC50值分别为661.19、413.86、22.36和135.27 μg/mL;SEP在Fe2+螯合模型和·OH自由基清除模型中的EC50分别为885.44和41.2.36μg/mL;，AEP在Fe2+螯合模型和·OH自由基清除模型中的EC50分别为771.37和600.08 μg/mL。　　4、对盾叶薯蓣水提多糖WEP的提取工艺过程进行了优化。通过单因素实验，确定了盾叶薯蓣水提多糖WEP得率有显著影响的取值范围，分别为：料液比1∶20～1∶60g∶mL、提取温度60～100 ℃、提取时间60～180 min。并且采用中心组合设计(CCD)和响应面分析方法(RSM)进一步优化了研究变量，建立了WEP得率与研究变量之间的二次多项回归方程，确定了WEP的最佳提取条件为：料水比为1∶52 g∶mL、提取温度为94 ℃、提取时间为147 min时，WEP得率达到最大值10.77%。　　5、研究了三种不同表面活性剂和氧载体对盾叶薯蓣内生真菌Dzf12产螺二萘类化合物的影响。　　结果表明，Tween-20 (0.2%，v/v)和液体石蜡(4%，v/v)的效果最好，palmarumycins C12和C13的总产量分别是344.25和353.89 mg/L;然后对其不同添加天数进行优化，发现在第6d添加，其总产量分别是350.71和373.69 mg/L。在加入液体石蜡的同时，再加入表面活性剂Tween-20，palmarumycins C12和C13的总产量为402.09 mg/L，与对照(138.50 mg/L)相比，产量提高了2.90倍。

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