白芍总苷抗肝纤维化作用及其对肝星状细胞G蛋白偶联信号转导的影响

摘要

本研究采用经典的CCl4诱导的肝纤维化模型，首先从整体上考察了TGP的抗化学性肝纤维化作用，然后选用HSC-T6细胞株，研究了TGP体外抑制血清和细胞因子血小板衍生生长因子BB(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF-BB)、转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1)刺激HSC-T6细胞增殖和胶原合成的抑制作用的量效和时效关系，最后采用Western-blot技术从蛋白表达水平观察了TGP对PDGF-BB、TGF-β1刺激后的G蛋白表达改变情况，进而对TGP抑制HSC-T6细胞增殖和胶原合成与G蛋白-AC-cAMP通路的关系作了初步探讨。 整体实验表明TGP具有明显的抗肝纤维化作用，其机制与改善肝纤维化大鼠肝脏的氧应激状态、作用于KC抑制炎性细胞因子的生成、作用于HSC抑制致纤维化细胞因子的生成等有关。细胞实验表明体外TGP(15～240mg·L-1)可以呈浓度时间依赖性的抑制各种刺激因素引起的HSC-T6细胞增殖和胶原合成。分子生物学实验表明细胞因子刺激HSC-T6增殖反应和胶原合成与G蛋白-AC-cAMP通路密切相关，TGP可以通过此通路从而影响HSC-T6细胞增殖和胶原合成。

目录

论文说明：英文缩略词表

学位论文独创性声明及学位论文使用授权声明

1.前言

2.材料与方法

2.1实验材料

2.1.1动物和细胞株

2.1.2药物与试剂

2.1.3仪器与设备

2.2实验内容和方法

2.2.1 CCl4致大鼠化学性肝纤维化模型的制备

2.2.2实验分组与给药方案

2.2.3大鼠顶枯否细胞（Kupffer Cell,KC)和HSC的分离与培养

2.2.4 KC炎性细胞因子的诱导与检测

2.2.5原代HSC的增殖实验与产生胶原的检测方法

2.2.6 HSC-T6细胞增殖和胶原合成的检测方法

2.2.7 ALT和AST活性测定

2.2.8肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量测定

2.2.9血清HA、LN含量的测定

2.2.10血清PCⅢ、CⅣ测定

2.2.11 MDA含量测定

2.2.12 SOD活性测定

2.2.13 GSH-px活性测定

2.2.14 NO含量测定

2.2.15血清TGF-β 1和PDGF水平的测定

2.2.16 TNF-α和IL-1β水平的测定

2.2.17肝脏病理组织学观察及评分标准

2.2.18肝脏免疫组织化学(S-P)染色方法

2.2.19蛋白免疫印迹法（ Western blot）检测HSC细胞膜的G蛋白和Ⅰ型胶原的表达

2.2.20 HSC cAMP的测定

2.2.21统计处理

3.结果

3.1 TGP对CCl4诱导的化学性肝纤维化大鼠的保护作用

3.1.1 TGP对CCl4诱导的化学性肝纤维化大鼠血清转氨酶和白/球比值的影响

3.1.2 TGP对CCl4诱导的化学性肝纤维化大鼠血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ含量的影响

3.1.3 TGP对CCl4诱导的化学性肝纤维化大鼠肝匀浆Hyp的影响

3.1.4 TGP对CCl4诱导的化学性肝纤维化大鼠肝脏病理组织学的影响

3.1.5 TGP对CCl4诱导化学性肝纤维化大鼠肝匀浆MDA，SOD和GSH-Px水平的影响

3.1.6 TGP对CCl4诱导化学性肝纤维化大鼠血清TNF-α、IL-1β和NO含量的影响

3.1.7 TGP对CCl4诱导化学性肝纤维化大鼠血清TGF-β1和PDGF含量的影响

3.1.8 TGP对CCl4诱导化学性肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1和PDGF-BB表达的 影响

3.1.9 TGP对CCl4诱导化学性肝纤维化大鼠HSC增殖和产生胶原的影响

3.1.10 TGP对CCl4诱导化学性肝纤维化大鼠肝组织MMP和TIMP表达的影响

3.1.11 TGP对CCl4诱导化学性肝纤维化大鼠KC产生TNF-α、IL-1β和NO的影响

3.1.12体外不同浓度的TGP对正常和模型组大鼠KC产生TNF-α、IL-1β和NO的影响

3.2 TGP对不同条件刺激下HSC-T6细胞增殖和胶原合成的影响

3.2.1体外不同浓度TGP的毒性作用

3.2.2 TGP对PDGF-BB刺激HSC-T6细胞增殖的影响

3.2.3 TGP对TGF-β1刺激HSC-T6细胞胶原合成的影响

3.2.4 TGP对混合血清刺激HSC-T6细胞增殖和胶原的影响

3.3 PDGF-BB诱导的HSC-T6细胞G蛋白-AC-cAMP通路改变及TGP的作用

3.3.1 PDGF-BB诱导的HSC-T6细胞膜Gi1、Gi2、Gi3、和Gs表达水平变化

3.3.2 PDGF-BB诱导的HSC-T6细胞cAMP产生的影响及其与增殖反应的关系

3.3.3 TGP对PDGF-BB诱导的HSC-T6细胞膜Gi2表达水平变化的影响

3.3.4 TGP对PDGF-BB诱导的HSC-T6细胞cAMP产生和细胞增殖反应的影响

3.4 TGF-β1诱导的HSC-T6细胞G蛋白-AC-cAMP通路改变及TGP的作用

3.4.1 TGF-β1诱导的HSC-T6细胞Gi1、Gi2、Gi3和Gs表达水平变化

3.4.2 TGF-β1诱导的HSC-T6细胞cAMP产生的影响

3.4.3 TGP对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞Gi2、Gs、Ⅰ型胶原表达水平变化影响

3.4.4 TGP对TGF-β1诱导HSC-T6细胞cAMP产生和胶原合成的影响

4.讨论

4.1 TGP对大鼠CCl4性肝纤维化的保护作用

4.2 TGP的抗氧化和对抑制炎性细胞因子生成作用

4.3 TGP对HSC细胞增殖和胶原合成的影响

4.4 HSC增殖反应和胶原合成的G蛋白-AC-cAMP通路改变以及TGP的作用

5.结论

参考文献

附录

致谢

综述：肝星状细胞的激活及其细胞内信号转导机制研究进展

1.影响肝星状细胞基因调节的转录因子

2.与HSC激活有关的细胞

3.HSC持续激活后功能特征

4.HSC增殖的细胞内信号传导

5.TGF-β影响HSC胶原分泌的细胞内信号传导

6.结语

参考文献