血液细胞靶向性腺病毒载体的构建及功能检测

摘要

目前基因转运方法很多，其中包括物理方法、化学方法、融合法、基因枪等。上述基因转移方法各有优点，但共同问题是基因转移效率低，较难获得稳定表达的细胞。腺病毒载体由于具有宿主范围广、能制备高滴度病毒、感染效率高、高表达目的基因、能感染增殖及静止两类细胞、不与宿主细胞基因组DNA结合、容许插入大片段外源基因等特点而受到人们的青睐。 多数用于基因转移的腺病毒载体都来自于5型或2型腺病毒(Ad5和Ad2)，但很多血液系统来源的细胞对腺病毒感染具有天然的抵抗性，因此限制了该载体在造血研究领域的应用。腺病毒纤维蛋白在腺病毒黏附到靶细胞的过程中起关键作用，不同腺病毒亚型可能会具有不同的组织或细胞趋向性，因为它们的纤维蛋白会识别不同的细胞表面受体。血液细胞表面具有B组腺病毒Ad11p的高效结合受体，可以通过对5型腺病毒载体进行纤维改造，使其具有B组腺病毒的趋向性，从而增强对血液细胞的基因转移效率。 本研究以AdEasy系统为基础，先用递归PCR的方法人工合成人B组11p型腺病毒的部分纤维(fiber)基因，测序正确后，经过多次的酶切连接操作，将其替换AdEasy骨架质粒中的人5型腺病毒的fiber基因，得到新的腺病毒骨架质粒命名为AdEasy-1/F11p，应用带有绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)报告基因的穿梭质粒pShuttle-GFP与AdEasy-1/F11p腺病毒DNA在BJ5183细菌内进行同源重组得到重组腺病毒质粒，切取重组腺病毒基因组DNA，脂质体转染法将其转运到293包装细胞内获得重组腺病毒，命名为Ad5F11p-GFP。同时以GFP监测腺病毒载体包装、扩增及滴度测定。为了检测改建后的重组腺病毒感染血液细胞的能力，以Ad5-GFP作对照，应用纯化后的重组腺病毒感染白血病细胞系、原代白血病细胞以及脐带血来源的CD34+造血干细胞，流式细胞仪检测GFP的表达。结果显示这种改建后的重组腺病毒能靶向结合血液细胞，其转染血液细胞的能力明显提高，显示出很好的应用前景。

目录

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缩略词对照表

前言

第一部分杂合纤维蛋白基因Ad5/F11p fiber的克隆及嵌合型腺病毒质粒pAdEasy-1/F11p的构建

第二部分携带GFP报告基因的靶向性腺病毒载体的构建及包装

第三部分携带GFP报告基因的靶向性腺病毒载体的功能检测及其初步机理探讨

总结

参考文献

文献综述靶向性腺病毒载体的研究进展

致谢

附录 个人简历