FK506对糖尿病大鼠早期肾脏肥大的抑制作用及机制的实验研究

摘要

背景与目的：糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是引起终末期肾病(Endstage renal diseaSe，ESRD)主要原因之一，其早期特征性病理改变为肾脏肥大、细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)集聚和基底膜增厚，随后发展为肾小球硬化，导致 ESRD。对 DN 发病机制的研究既往多集中在血糖、血脂代谢紊乱、血流动力学异常、氧化应激与炎症等方面。近年研究发现糖尿病状态下，多种激素、细胞介质及肽类生长因子如胰岛素样生长因子-I(Insulin-like growth factor,IGF-I)与转化生长因子-β1(Transforming growth factorβ1，TGFβ1)都可引起肾脏肥大与ECM集聚。尽管IGF-I与TGF-β1可以激活多种细胞内信号转导发挥其不同的病理牛理作用，但致细胞肥大与ECM集聚作用主要与激活钙依赖性丝氨酸/苏氨酸磷酸酶钙神经蛋白(Calcineurin，CaN)信号转导途径有关。本研究旨在探讨 CaN抑制剂 FK506 对糖尿病大鼠早期肾脏肥大的抑制作用及其机制。 方法:建立链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠模型，随机分成4组：对照组(C)、模型组(DM)、FK506 0.5 mg/kg给药组(DM+FK506 0.5 mg/kg.)及 FK506 1.0mg/kg给药组(DM+FK506 1.0 mg/kg)，每组10只。FK506灌胃给药，对照组和模型组给予等量溶媒，观察4刷。血糖、肝功能、肾功能与血脂由全自动生化分析仪测定，24小时尿白蛋白测定采用酶联免疫方法(Enzyme Immunoassay，EIA)。观察大鼠肾重/体重、尿白蛋白排泄率(AER)与肌酐清除率(Ccr)变化，并行肾组织病理形态学分析。应用 Western 印迹或免疫组化方法检测肾组织.钙神经蛋白(Calcineurin，CaN)、1α(Ⅳ)型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)与转化生长因子β1(TGFβ1)蛋白表达。 结果：1.各组大鼠一般指标变化：模型组大鼠表现为血糖升高、体重下降、相对肾重(肾重/体重)增加(P<0.01)，FK506 0.5与1.0mg/kg给药4wk没有防止大鼠血糖升高、体重下降。FK506 0.5mg/kg给药组相对肾重较糖尿病组有所下降，但未达统计学意义，FK506 1.0mg/kg给药组相对肾重明显低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠AER明显高于对照组(P<0.01)，FK506 0.5与1.0mg/kg 给药组大鼠AER水平明显低于模型组(P<0.05，0.01)。FK506 0.5与1.0mg/kg给药组大鼠Ccr水平与模型组相比，差异无统计学意义。模型组大鼠血TC、TG水平明显高于对照组(P<0.05)，FK506 0.5与1.0mg/kg给药组血 TC、TG水平与模型组相比无明显差异。另外，与对照组相比，模型组、各给药组血谷丙转氨酶、谷草转氨酶无明显变化。 2.肾组织病理形态学变化：模型组4周肾小球平均容量(V<,G>)与损伤指数(Indices for tubulointerstitial injury,TII)明显高于对照组(P<0.05，0.01)，提示本模型大鼠已出现肾小球肥大与肾小管.间质损害：FK5060.5mg/kg给药组大鼠V<,G>明显低于模型组(P<0.05)，TII较模型组有所下降，但差异未达统计学意义，FK506 1.0mg/kg给药组 V<,G>与TII均明显低于模型组(P<0.05，0.01)。 3.各组大鼠肾组织 CaN 蛋白表达变化：模型组肾组织。CaN 蛋白表达较对照组增加2.4倍，FK506 0.5与1.0mg/kg给药4周分别使肾组织CaN蛋白表达下降38.0％与73.2％。 4.各组大鼠肾组织1α(Ⅳ)型胶原表达变化：模型组肾组织1α(Ⅳ)型胶原蛋白表达较对照组增加2.4倍，FK506 0.5，1.0mg/kg给药4wk分别可使肾组织1α(Ⅳ)型胶原蛋白表达下降34.5％与50.0％。 5.各组大鼠肾组织TGFβ1和α-SMA表达变化：对照组大鼠肾小球与肾小管.间质有微弱TGFβ1蛋白表达，模型组肾小球与肾小管-间质TGFβ1蛋白表达明显高于对照组(P<0.01)，K506 0.5与1.0mg/kg给药组肾小球与肾小管-间质TGFβ1蛋白表达明显低于模型组(P<0.05，0.01)。Westem印迹条带光密度分析显示模型组肾组织α-SMA蛋白表达较对照组增加3.5倍，FK506 0.5，1.0mg/kg给药4周分别可使肾组织α-SMA蛋白表达下降40.7％与69.1％。 结论:FK506对糖尿病大鼠肾脏肥大有明显抑制作用，其机制与下调肾组织增高的CaN表达有关。

目录

论文说明：英文缩略词

声明

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.1.1动物

2.1.2药品

2.1.3试剂

2.1.4仪器与设备

2.2方法

2.2.1建立大鼠糖尿病模型

2.2.2动物分组及处理

2.2.3标本收集

2.2.4血、尿生化指标测定

2.2.5尿白蛋白排泄率(AER)测定

2.2.6内生肌酐清除率(Ccr)测定

2.2.7肾脏组织病理形态学分析

2.2.8肾组织TGFβ 1免疫组织化学

2.2.9Western blot

2.2.10统计学处理

3结果

3.1各组大鼠一般指标变化

3.2各组大鼠肾组织Calcineurin蛋白表达变化

3.3各组大鼠肾组织病理形态学观察

3.4各组大鼠肾组织1α(Ⅳ)型胶原表达变化

3.5各组大鼠肾组织TGFβ1和α-SMA表达变化

附图

4讨论

4.1糖尿病肾病发病流行现状与趋势

4.2糖尿病肾病发病机制

4.3糖尿病肾病治疗概况

4.4 FK506对糖尿病肾病抑制作用机制

4.4.1 FK506对糖尿病大鼠肾脏保护作用

4.4.2 FK506对糖尿病大鼠肾内CaN磷酸酶活性的影响

4.4.3 FK506对糖尿病大鼠肾内1α(Ⅳ)型胶原表达的影响

4.4.4 FK506对糖尿病大鼠肾内TGFβ1表达的影响

4.4.5 FK506对糖尿病大鼠肾内α-SMA表达的影响

5小结

6参考文献

附录

致谢

综述：糖尿病肾病发病机制研究进展