川芎挥发油保护血管内皮细胞有效成分筛选及藁本内酯的作用机制研究

摘要

目的：筛选川芎挥发油中具有保护血管内皮细胞作用的有效成分，并探讨其有效成分藁本内酯（LIG）对血管内皮细胞保护作用的机制。　　方法：建立人脐静脉内皮细胞（HUVEC）糖氧剥夺-再灌注（OGD-R）损伤模型。采用MTT法筛选川芎挥发油中对HUVEC OGD-R损伤具有保护作用的有效成分；通过高内涵（HCS）、蛋白印迹（Western Blot）等手段，探讨LIG对OGD-R损伤HUVEC中PI3K-Akt信号通路的影响；复制斑马鱼血管新生障碍模型观察LIG对血管新生的影响。　　1.川芎挥发油保护血管内皮细胞有效成分筛选　　采用含有Na2S2O4的无糖培养基培养12h模拟糖氧剥夺状态，再正常培养4h模拟再灌注状态，建立HUVEC OGD-R损伤模型；分别给予不同浓度的川芎挥发油、LIG、丁基苯酞（BP）、洋川芎内酯A/I、欧当归内酯A、川芎嗪（TMP）、阿魏酸，预给药1 h，采用MTT法测定不同药物对模型细胞活力的影响。选择具有保护作用的LIG和BP，以20、40、60μM对HUVEC OGD-R损伤模型预给药，检测细胞内MDA、SOD及细胞培养液中LDH、ACP的含量。　　2. LIG保护血管内皮细胞的作用机制研究　　（1）LIG对OGD-R损伤HUVEC的保护作用和PI3K-Akt通路影响的研究。将培养好的细胞分为空白组、模型组和LIG低、中、高浓度药物干预组（20、40、60μM）。预给药及造模后，观察细胞形态、检测细胞培养液中NO含量与细胞中NOS活性；用HCS系统测定各组细胞内PI3K p85、PDPK1、HIF-1α、VEGF的表达，并进行细胞周期测定；采用western blot法检测细胞内Tubulin的表达。　　（2）抑制PI3K通路对LIG细胞保护作用的研究。参考前期分组，以含有10μM的LY294002和60μM的LIG细胞培养液预给药处理增设抑制剂组，其它实验组的设置与处理方法同前；OGD-R损伤后，用HCS系统测定各组细胞中p53的表达情况；用Western Blot法检测各组细胞中Akt/p-Akt、GSK3β/p-GSK3β、Bcl-2、Bax、Caspase-3/Cleaved Caspase-3的相对表达量，比较PI3K通路抑制状态下对LIG细胞保护作用的影响。　　（3）LIG对斑马鱼血管新生障碍影响的研究。选择24 hpf的Tg（kdrl：eGFP）品系斑马鱼卵，用血管内皮生长因子受体抑制剂（VRI）复制血管新生障碍模型，给予10-60μM的LIG作用21 h后，用荧光显微镜观察斑马鱼节间血管（ISVs）出芽情况并计算其出芽率；用RT-PCR法检测斑马鱼VEGF A、Kdr、Kdrl及Flt-1 mRNA的相对表达量。　　结果：　　1.川芎挥发油保护血管内皮细胞有效成分筛选结果。　　试验确定用浓度为8 mM的Na2S2O4建立HUVEC OGD-R损伤模型。MTT法检测结果显示，与模型组相比，川芎挥发油稀释至浓度0.031%、0.016%下可明显升高细胞活力（P<0.05），而在浓度0.125%、0.25%、0.5%时反而降低细胞活力（P<0.05），呈毒性表现。TMP、LIG、BP在30-60μM可明显升高细胞活力（P<0.05），且后两者呈较好的量效正相关；洋川芎内酯I在60μM、阿魏酸在40、60μM对OGD-R损伤的HUVEC细胞活力具有保护作用（P<0.05）；欧当归内酯A在40、60μM则能使细胞活力下降（P<0.05）；洋川芎内酯A在试验浓度范围内对模型细胞活力无明显影响。选择呈较好量效相关性的LIG和BP进一步观察其对细胞损伤的影响。结果显示：与模型组相比，20、40、60μM的LIG预给药可剂量相关性降低模型细胞内MDA含量和细胞培养液中LDH含量（P<0.05），40、60μM还可升高细胞内SOD的活性（P<0.05）；20、40、60μM的BP预给药则可剂量相关性降低模型细胞内MDA含量（P<0.05），40、60μM可降低细胞培养液中LDH含量和升高细胞内SOD的活性（P<0.05）；OGD-R损伤后的HUVEC细胞培养液中ACP含量呈上升趋势，LIG与BP预给药对细胞培养液中ACP含量变化无明显影响。　　2. LIG保护血管内皮细胞作用机制研究结果。　　（1） LIG对OGD-R损伤HUVEC的保护作用和PI3K-Akt通路的影响。与空白对照组比较，OGD-R损伤后的HUVEC培养液中NO含量和细胞内NOS活性均明显降低，细胞内PI3K p85、HIF-1α与VEGF表达增加、细胞分裂增加（P<0.05），PDPK1和Tubulin的表达有增加趋势。与模型组比较，LIG预给药20、40、60μM能明显提升损伤的HUVEC细胞培养液中NO含量（P<0.05），预给药20、40μM能使细胞内NOS活性升高（P<0.05），在20、40、60μM浓度下剂量相关性地促进细胞内PI3K p85、PDPK1和VEGF的表达、促进细胞分裂、提高HIF-1α与Tubulin在细胞内的表达（P<0.05）。　　（2）抑制PI3K通路对LIG细胞保护作用的影响。结果显示，与空白组比较，OGD-R损伤增加HUVEC细胞内Bax、Cleaved Caspase-3、p53的表达（P<0.05），降低Bcl-2的表达（P<0.05），但对Akt/p-Akt、GSK3β/p-GSK3β的表达无明显影响。与模型组比较，LIG预给药20、40、60μM组可促进细胞内p-Akt、p-GSK3β、Bcl-2的表达（P<0.05），降低Bax、Cleaved Caspase-3、p53的表达（P<0.05），对Akt和GSK3β表达无明显影响。与LIG预给药60μM组比较，联用抑制剂组细胞内Bax、Cleaved Caspase-3与p53的表达提升（P<0.05）， p-Akt、p-GSK3β和Bcl-2的表达降低（P<0.05），Akt和GSK3β表达在两组间无明显差异。　　（3）LIG对斑马鱼血管新生障碍的影响。实验确定以浓度300 nM的VRI作用于24 hpf斑马鱼卵，制备血管新生障碍模型。LIG的毒性研究发现，100μM的LIG可明显抑制斑马鱼孵化率（P<0.05），80μM的LIG对斑马鱼孵化率也有抑制趋势，故本实验中LIG的给药浓度确定为10、20、40、50、60μM。结果发现，与模型组相比，LIG在10、20、40、50、60μM浓度下剂量相关性促进斑马鱼血管新生障碍模型的ISVs出芽率（P<0.05）；与空白组比较，VRI造模后斑马鱼VEGF A、Kdr、Kdrl、Flt-1 mRNA表达均明显下降（P<0.05）；与模型组比较， LIG20、40、60μM均可明显提升上述mRNA表达（P<0.05)。　　结论：　　1.川芎挥发油具有对抗OGD-R损伤导致HUVEC细胞活力下降的作用，其主要有效成分有LIG、BP和洋川芎内酯I，且前两者有较好的量效正相关性，对本模型细胞有抗氧化损伤和保护细胞膜稳定性的作用。　　2.LIG对抗OGD-R导致HUVEC损伤的作用机制与抗缺氧损伤、激活PI3K-Akt通路有关。　　3.LIG具有促进血管新生的作用，其机制与上调VEGF/VEGFR相关mRNA表达有关。

目录

缩略词表

前言

1. 血瘀证的传统认识和治疗原则

2.血瘀证与血管内皮细胞的损伤

3. 活血化瘀中药保护血管内皮细胞损伤的作用机制

4. PI3K-Akt通路与血瘀证血管内皮细胞损伤的关系

5. 川芎及川芎挥发油的药效及药理

6. 本研究的思路与方法

1.川芎挥发油保护血管内皮细胞有效成分筛选

1.1.实验材料

1.2.实验方法

1.3.数据处理及统计分析

1.4.实验结果

2.LIG保护血管内皮细胞的作用机制研究

2.1.实验材料

2.2.实验方法

2.3.数据处理及统计分析

2.4.实验结果

讨论

1. 川芎挥发油药效及其对血管内皮细胞的作用

2. 血瘀证血管内皮细胞损伤模型与本研究模型的选择

3. 川芎挥发油保护血管内皮细胞的活性成分

4. LIG保护血管内皮细胞的作用机制

5. LIG的血管新生促进作用

结论

创新点

问题与展望

致谢

参考文献

附录I：综述:川芎挥发油化学成分与药理作用研究

附录II在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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